amiRNA干扰NMHC II-A对PRRSV感染细胞凋亡信号传导的影响及机制

Cell apoptosis caused by virus infection is not only an antiviral defense mechanism, but also a strategy for virus escaping immune response and/or developing persistent infection. Research found that American type porcine productive and respiratory syndrome virus(PRRSV), represented by strain ATCC VR-2332, and Europe type PRRSV, represented by strain LV, all could induce cell apoptosis both in vitro and in vivo, and the induction mechanism was related with virus pathogenesis. PRRSV infected susceptible cells by binding with specific receptor on the surface of the cell membrane and cells endocytosis. Nonmuscle myosin heavy chain II-A(NMHC-IIA) is a PRRSV receptor identified recently. In this study, NMHC-IIA expression of Marc145 cells was interfered using artificial microRNA, then the effect and its mechanism of PRRSV infected NMHC-IIA knockdown cells on cell apoptosis signaling transduction will be explored. Then, biological function of NMHC-IIA in PRRSV infection will be clarified and PRRSV pathogenesis mechanism will be further revealed by analyzing those results.

病毒感染触发的细胞凋亡既是机体抗病毒防御机制之一，也是病毒逃避免疫应答和/或诱发持续感染一种策略。研究发现，以ATCC VR-2332株为代表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和以LV株为代表的欧洲型PRRSV均可在体内外诱导细胞凋亡，且诱导机制与病毒致病机制有关。PRRSV是通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用而感染易感细胞，非肌肉肌球蛋白II型重链A（NMHC-IIA）是新确定的PRRSV的辅助受体。本研究利用人工微小RNA（artificial microRNAs, amiRNAs)干扰Marc-145细胞 NMHC-IIA的表达，通过探讨PRRSV感染对敲低NMHC-IIA的细胞凋亡信号传导的影响及其机制，进而阐明NMHC-IIA在PRRSV感染过程中的生物学功能，为进一步揭示PRRSV的致病机理提供材料，为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供理论依据。

病毒感染触发的细胞凋亡既是机体抗病毒防御机制之一，也是病毒逃避免疫应答和/或诱发持续感染一种策略。研究发现，美洲型和欧洲型PRRSV在体内均可外诱导细胞凋亡且诱导机制与病毒致病机制有关。PRRSV通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用感染易感细胞，非肌肉肌球蛋白II型重链A（NMHC-IIA）是本研究团队新确定的PRRSV辅助受体。为了研究NMHC-IIA在PRRSV感染中的作用，我们团队利用人工微小RNA（amiRNAs）干扰技术建立了特异性稳定敲低MARC-145细胞NMHC-IIA表达的细胞系MARC-145amiRNMHC-IIA（P4）和对照细胞系MARC-145amiRNC（P5），发现干扰NMHC-IIA表达可以抑制PRRSV感染。本研究利用此细胞系探索稳定敲低NMHC-IIA表达对PRRSV感染细胞第二信使水平、细胞凋亡与坏死、NF-κB移位、ROS变化等的影响及其机制，为进一步揭示PRRSV致病机理提供理论资料。研究发现利用amiRNA 稳定干扰 NMHC-IIA表达虽然导致cAMP浓度降低，但与MARC-145及P5细胞的相比，差异并不显著；通过对PRRSV感染前后细胞DNA片段化、膜内侧PS外翻、凋亡指数、Caspases活性、细胞色素C释放、HMGB1表达水平等检测，发现干扰NMHC-IIA表达并没有促进或抑制PRRSV感染引起的细胞凋亡与坏死；利用IFA结合激光共聚焦显微镜技术检测PRRSV感染前后NF-κB核移位，发现虽然PRRSV感染可以引起NF-κB明显向核移位，但干扰 NMHC-IIA表达并不影响PRRSV感染引起的NF-κB核移位；Western blot方法检测PRRSV感染前后3种细胞内引起NO浓度改变的iNOS表达水平，未发现明显区别；利用DCFH-DA结合荧光酶标仪检测ROS产生水平，发现PRRSV感染前后P4细胞产生的ROS比MARC-145和P5细胞的显著降低（p<0.05）。表明作为新发现的PRRSV细胞受体，虽然干扰其表达可以抑制PRRSV的感染，但对PRRSV感染引起的细胞凋亡和坏死及其相关的信号通路并没有明显的影响，因此通过干扰PRRSV细胞受体NMHC-IIA的表达抑制病毒感染可以作为防治PRRS的新靶点。