miR-148a对iPSCs的心肌分化能力和心肌梗死治疗效果的调节机制研究

Induced pluripotent stem cells (iPSCs), with unlimited proliferation and differentiation potential, hold great promise for cell therapy in myocardial infarction. However, ongoing issues such as cell immaturity and cell purity of iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) will need to be resolved before clinical application. Our preliminary studies found that: 1) compared with the iPSCs, the expression of miR-148a significantly increased in iPSC-CMs; 2) knockout of miR-148a obviously attenuated the amount and maturity of cardiomyocytes differentiated from iPSCs. However, the mechanisms by which miR-148a regulates the cardiac differentiation from iPSCs remain unclear. This project is to compare the cardiac differentiation potential of miR-148a-overexpressing or defective iPSCs; explore the regulatory mechanisms and networks mediating miR-148's function by gene chips, target gene validation and gene rescue experiments; and evaluate the effects of miR-148a on the therapeutic efficacy of iPSC-CMs in myocardial infarction. These studies will help to improve current methods for iPSC-CMs generation, and to promote the clinical research and application of iPSCs for cell therapy of myocardial infarction and other heart diseases.

诱导多能干细胞（iPSCs）因具有无限增殖和多向分化潜能，是细胞移植治疗心肌梗死的理想种子细胞之一。但iPSCs衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）的纯度和成熟度不高，是限制iPSCs临床应用的瓶颈问题之一。我们前期研究发现：1）与iPSCs相比，miR-148a在iPSC-CMs中的表达显著升高；2）miR-148a敲除可明显抑制iPSCs衍生的心肌细胞数量和成熟度。但miR-148a在iPSC-CMs分化中的作用机制仍不清楚。本课题将构建miR-148a过表达、干涉和敲除的iPSCs克隆，研究miR-148a对iPSCs向心肌细胞分化能力的影响；利用基因芯片、靶基因验证和功能挽救实验探索miR-148的调控机制和网络；评估miR-148a对iPSC-CMs治疗心梗的疗效的影响。本课题的顺利开展将为改良iPSC-CMs诱导方法提供依据，促进iPSC治疗心肌梗死等心脏疾病的临床研究和应用。

人胚胎干细胞（Human embryionic stem cells, hESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, hiPSCs）在心血管疾病模型构建、细胞治疗和药物开发等领域有广泛的应用前景。当前hESCs向心肌细胞定向分化存在效率低、均一性不好等问题，严重制约了干细胞在心血管领域的基础研究和临床应用。miRNAs在心脏发育和体外心肌细胞分化等方面均发挥重要调节作用。本研究拟阐明MIR148A家族在干细胞向心肌细胞定向分化中的功能及其可能调控机制，以期为心脏疾病治疗提供种子细胞。.本课题首先利用qPCR方法发现MIR148A家族三个成员MIR148A、MIR148B和MIR152在hESCs向心肌细胞定向分化过程中表达水平持续性上升。项目组利用CRISPR-Cas9技术构建MIR148A家族成员全敲除的hESC系（MIR148A-TKO），发现MIR148A家族全敲除后可显著抑制心肌细胞分化效率，而MIR148A家族成员过表达可促进心肌分化。MIR148A家族全敲除明显抑制心肌分化第4天侧板中胚层标志分子（MESP1和FOXF1）和第6天心脏前体细胞标志分子（ISL1和NKX2.5）的表达水平。在心肌分化第4天时，MIR148A家族敲除组中MESP1阳性细胞的比例明显降低，DLL1（轴旁中胚层标志分子）阳性细胞的比例明显升高。RNA表达谱分析进一步证实MIR148A敲除可抑制侧板中胚层/心脏前体细胞相关基因的表达，促进轴旁中胚层关键基因表达；且Notch信号通路相关基因在MIR148A家族敲除组细胞中显著富集。靶基因预测和验证结果显示MIR148A家族可靶向抑制Notch信号通路配体DLL1的mRNA和蛋白表达水平，从而削弱Notch信号通路的抗心肌分化能力；DLL1干涉后可逆转MIR148A家族敲除引起的心肌分化效率降低的表型。本课题进一步比较了MIR148A差异表达干细胞分化心肌细胞治疗心肌梗死的疗效，心功能改善程度无明显差别。.总之，本研究揭示了MIR148A家族在心肌分化中的功能，发现MIR148A家族主要通过抑制DLL1介导的Notch信号通路来维持干细胞向侧板中胚层/心脏前体细胞分化命运，进而促进心肌细胞分化。该研究为改善心肌细胞分化方法，获得充足心脏疾病治疗所需种子细胞提供了理论和技术支撑。