乙肝核心蛋白嵌合病毒样颗粒的化学修饰及其在肝癌的靶向性基因治疗中的应用

本项目拟围绕着构建能安全、高效地靶向肝癌组织的非病毒载体这一核心问题，以乙肝核心蛋白病毒样颗粒（HBcAg VLPs）为基础来设计多功能化的基因载体。本项目的学术思路为：（1）通过将具有肝靶向性的乙肝表面抗原PreS1肽段展示在具有核定位能力的HBcAg VLPs表面来构建一种能特异性靶向肝细胞的新型转运载体；（2）结合基因定点突变技术和点击化学方法对所构建的VLPs进行化学修饰，以赋予其肿瘤靶向能力并降低其抗原性；（3） 通过阐明VLPs在体外的自组装规律，实现所构建的VLPs能对核酸等外源治疗性分子的可控负载及释放。本项目还拟采用多种生物技术进行体内外表征，探讨所构建的 VLPs的胞内输运途径、体内代谢行为及其作为基因载体系统的可行性；并以HSV-TK自杀基因为模型药物，探索所构建VLP所介导的纳米基因系统在肝癌治疗中的分子机制和意义，从而为肝癌的基因治疗提供新载体、探索新方法。

病毒样颗粒是由病毒的一种或几种结构蛋白组成的空心颗粒，不含病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，其在形态上与真正病毒颗粒相同或相似。由乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）组成的病毒样颗粒, 可以自组装形成正二十面体并具有良好的解聚/自组装功能，因其独特的结构和免疫学特性, 不仅可作为基因/药物设计的理想载体，还有可能在免疫治疗中发挥作用。本文利用基因工程方法构建，通过原核表达系统诱导表达多种以HBcAg为基础的嵌合病毒样颗粒（HBc VLPs）。此外，还将具有功能化纳米材料高效地负载于病毒样颗粒内部，以期探讨嵌合HBcAg病毒样颗粒在肿瘤治疗中的应用潜能。主要研究及结果如下：.1）利用大肠杆菌系统表达出的HBc VLPs，能够在一定的条件下进行解聚和重组。研究发现盐酸胍、尿素或含EGTA和DTT的变性试剂均能很好的解离HBc VLPs，且解离后的HBc VLPs在4℃下过夜透析去除变试剂后均能够不同程度的实现重组。采用PEI等带阳离子聚合物可诱导质粒DNA的坍塌，从而提高HBc VLPs对其的包载效果。HBc VLPs作为载体包裹坍塌型质粒后，能够大大降低坍塌质粒DNA的细胞毒性，并显著提高其细胞转染效率。.2）嵌合PreS1多肽的HBc病毒样颗粒能够有效地靶向肝肿瘤细胞；嵌合Tat/HA2的HBc VLPs能够有效地逃逸溶酶体；嵌合或在表面修饰有肿瘤导向肽（RGD）的HBc VLPs均能在其空腔包裹质粒DNA或抗肿瘤药物。细胞及动物水平研究证明嵌合HBc VLps作为药物/基因载体可高效地发挥作用。.3）利用镍离子-组氨酸化学方法，可构建具有壳核结构的HBcAg-144-His/ Fe3O4-NTA-Ni2+ VLPs，联合磁性纳米粒子和病毒样颗粒自身优势，所构建的磁性病毒样颗粒具有应用于体内的靶向磁共振成像的潜力。.4）免疫佐剂CpG ODNs可增强纳米金粒子的表面负电性，通过静电作用力及病毒样颗粒的自组装作用可构建CpG-Au@HBc核壳纳米结构。负载CpG-Au的嵌合HBc病毒样颗粒可在小鼠体内能够诱导产生较强的体液免疫反应和细胞免疫反应，同时不会对肝脏造成明显损伤。