EBV通过立早蛋白Zta调控IFNGR1逃避宿主免疫清除的研究

EBV is an important onco-virus,which is estimated to be responsible for ~1% of all human cancers. To evade the host immune clearance, the virus usually establish a asymptomatic latent infection status, but it is unable to identify that whether memory B cells infec latent EBV or not to remove EBV infection. The early results of our group finded that the overexpression of EBV immediate early protein Zta reducing the cell surface expression of IFNGR1, combined with literature and previous work foundation, we hypothesized that: Zta as the switcher of EBV from latent period to lytic, through downregulating the IFNGR1expression can affect IFN-γ signal pathway which participates in the antiviral immune response and body's antiviral state evading the host immune clearance during the period of phase transition then affecting the “cancer immunoediting” pcrocess of EBV associated tumors. This research will take the EBV related cancer cell lines as the model, acquiring the evidence of Zta rregulating the transcription activity of IFNGR1 promoter by Dual-Luciferase Reporter assay system ,EMSA and ChIP. detecting the expression of Zta and IFNGR1 in EBV related nasopharyngeal carcinoma, analysis the correlation between them. If confirmed the mechanisms by which EBV inhibits the expression of IFNGR1 molecules, not only helps reveal the mechanism how EBV envade the immune clearance. Not only provide strategies for the antiviral therapy,but also provide infromtion for EBV associated tumors early intervation and treament.

EB病毒感染与多种肿瘤密切相关，建立无症状的潜伏感染是EBV逃避宿主免疫清除的主要手段，目前无法鉴别携带潜伏期EBV及未受感染的记忆性B细胞。课题组前期发现过表达EBV立早蛋白Zta细胞表面IFNGR1表达降低的现象，结合文献和既往工作基础，我们推测:Zta作为EBV由潜伏期进入裂解期的开关分子，在潜伏期与裂解期转换时通过下调IFNGR1进而影响IFN-γ信号通路参与的抗病毒免疫反应及机体抗病毒状态来逃避宿主免疫系统的清除，并进一步影响EBV相关肿瘤的免疫编辑过程。本研究拟以EBV相关肿瘤细胞系为模型，从转录调控的角度以双荧光素酶实验、EMSA和ChIP实验获得Zta调控IFNGR1的证据，并在EBV相关鼻咽癌组织中检测Zta与IFNGR1，分析两者表达的相关性,从而进一步揭示裂解期EBV逃避宿主免疫防御的机制，不但为EBV感染控制提供证据,并为EBV相关肿瘤早期干预及治疗提供线索。

EBV是上世纪60年代被首个证实具有致瘤性的DNA病毒，又被称为人类４型疱疹病毒（HHV-4）， 是人群中最广泛感染的病毒种类之一。EBV与约1%的人类肿瘤密切相关，如：Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等发生发展密切相关。在前期研究中我们观察到EBV立早蛋白Zta过表达细胞表面IFNGR1表达降低的现象。我们通过获取IFNGR1近端-1500bp长度的启动子，经生物信息学分析发现其启动子区存在多个潜在的Zta反应元件（ZRE），通过构建含不同数量ZRE位点的系列IFNGR1启动子报告载体，将Zta表达载体、 IFNGR1启动子报告载体及内参荧光载体共转染细胞，通过双荧光素酶活性检测证实位于IFNGR1启动子远端的ZRE位点为功能性位点；通过构建DNA结合结构域缺失的cZta表达载体证实Zta的DNA结合结构域参与了Zta对IFNGR1在转录水平的抑制。在肿瘤细胞系中过表达Zta,通过RT-PCR、WB及FACS证实过表达Zta在蛋白及mRNA水平抑制IFNGR1表达。采用染色质免疫沉淀实验初步提示Zta与IFNGR1启动子-805位ZRE位点存在直接作用，于是我们将-805位ZRE位点进行突变，证实了该位点的功能性。通过流式细胞术对25例临床确诊传染性单核细胞增多症患者且EBV阳性儿童及18例正常体检儿童外周淋巴细胞表面IFNGR1检测发现，EBV阳性组IFNGR1在T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞表面存在不同程度的降低，且在B淋巴细胞表面的降低有统计学意义。通过对5例临床确诊传染性单核细胞增多症患者且EBV阳性儿童及5例正常志愿者全转录组二代测序的结果也证实IFNGR1的转录水平存在不同程度的降低。在本研究中，我们首次从EBV的病毒蛋白调控重要的免疫分子IFNGR1的分子机制入手，证实Zta通过IFNGR1启动子ZRE位点发挥抑制性转录调控作用，为EBV逃避宿主免疫清除提供了新的证据。