革兰氏阴性细菌质量控制因子SurA和FkpA等在外膜蛋白质生成过程中的功能及机制的在体研究

The biogenesis of the outer membrane proteins in Gram negative cells is considered a rather complex processes and thus their quality control is vital for opetimal cell growth. The quality control for the biogenesis of the beta-barrel outer membrane proteins is far from clear and in vivo study is especially lacking.This application will use E. coli as the model organism and focusing on two periplasmic quality control factors, SurA and FkpA. We will mainly conduct research on the following aspects: 1. to identify all the proteins interacting with them in living cells; 2. To understand their role in the biogenesis of beta-barrel outer membrane proteins; 3. to unveil the cooperation between SurA, FkpA and other quality control factors; 4. To characterize the unique role of FkpA under heat shock conditions。 We will perform our studies by employing the in vivo photo-crosslinking method using genetically incorporated non-natural amino acids,a method that we having been using in our lab to examine protein-protein interactions in living cells. This will allow us to identify all the proteins interacting with SurA and FkpA, thus to understand their function and action mechanism in living cells for the quality control of outer membrane proteins.

细菌外膜蛋白生成过程异常复杂，其质量控制极其重要。对β-桶外膜蛋白质生成的膜间质质量控制机制的认识还远不清楚,活体研究更是缺乏。本申请以大肠杆菌为模式生物，以膜间质分子伴侣SurA和FkpA为主要研究对象，在活细胞体内研究β-桶外膜蛋白质生成过程质量控制机制。具体内容包括：1、SurA和FkpA在活细胞内的天然相互作用蛋白质全谱鉴定；2、揭示SurA和FkpA参与β-桶外膜蛋白生成途径的分子机制；3、SurA和FkpA之间，及其与其它质量控制因子之间的协同作用机制；4、研究FkpA的功能重要性在热胁迫条件下凸显的机制。本研究中，我们将利用非天然氨基酸体内光交联技术。这是我们实验室多年来使用研究活细胞内蛋白质相互作用的有效方法。通过此项技术，我们可以实现在体内捕获和SurA、FkpA相互作用的蛋白质，包括天然底物和相互作用的功能因子，以此认识它们的功能和作用。

细菌β-桶外膜蛋白质（OMPs）的生成是一个复杂的过程。新生肽链在细胞质内合成后，需转运跨过内膜到亲水的膜间质区域，然后新生肽链在膜间质质量控制因子的辅助下，转运至外膜，在β-桶外膜蛋白质组装机器BAM复合物（部分整合于外膜，部分暴露在膜间质）的协助下完成后续的折叠组装和插膜过程。在此过程中，疏水性的β-桶外膜蛋白质如何在SurA等膜间质质量控制因子的作用下通过亲水的膜间质区域是一个很关键却了解较少的方面。. 本课题通过构建58个在不同氨基酸残基位点引入非天然氨基酸的SurA光交联突变体，应用活细胞交联技术对SurA不同结构域与底物或功能相关蛋白质的相互作用进行了系统检测，发现膜间质分子伴侣蛋白SurA主要通过其N端结构域与新生的β-桶外膜蛋白质相互作用，通过远离N端结构域的P2结构域与BAM中的关键组分BamA相互作用。我们还发现，SurA能够通过N端结构域与锚定在内膜上的蛋白质PpiD相互作用。为了验证以上的相互作用，我们在β-桶外膜蛋白质OmpF和LamB上引入了非天然氨基酸，检测了β-桶外膜蛋白质与SurA的相互作用谱，有趣的是，我们发现SurA均只与OmpF和LamB的N端和C端，而非中间肽链区域，发生相互作用。.本课题还通过蔗糖密度梯度离心分离细菌内外膜组分，结合Blue-Native凝胶电泳，免疫印迹及质谱鉴定分析，首次发现一种横跨内外膜的超分子复合体，构成一个整合的“β-桶外膜蛋白质生成通道”。这应该可以大大提高β-桶外膜蛋白质的生成效率。以上成果已经发表（具体见论文）。. 通过在OmpF的第362号位点引入光交联探针，本研究开发出一个鉴定外膜蛋白OmpF是否正确组装插膜的系统，通过此系统，本研究发现SurA对于外膜蛋白OmpF折叠形成闭合的桶状结构起到重要作用。. 尚未发表工作：1、外膜蛋白质的信号肽可能在外膜蛋白质抵达外膜并折叠到一定程度后才被切除，这与传统看法（信号肽在新生肽链跨过内膜后就立刻被切除）很不一致。2、外膜蛋白质是通过一种新的由截短的SecA（SecAN）形成的跨膜通道转运的，而非传统的SecYEG通道 (它仅仅负责膜间质蛋白质的转运)。