小分子热休克蛋白IbpA和IbpB在活细胞内和天然底物蛋白相互作用的分子机制以及生物学意义

小分子热休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）几乎存在于所有生物中，与其它热休克蛋白Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100一起组成经典的分子伴侣蛋白家族，参与广泛的生物学过程，如蛋白质的折叠、组装、运输、降解以及细胞的抗胁迫、分化、凋亡、衰老等，但目前对于它们在生物体内的作用机制还远不清楚。本实验室在过去的十多年间系统地研究了小分子热休克蛋白在体外发挥分子伴侣活性的机制，取得了一定的进展。本申请拟在原来以体外研究工作为主的基础上，深入到体内研究，以来自大肠杆菌的小分子热休克蛋白IbpA和IbpB作为模型，利用新技术手段（如非天然氨基酸体内交联法），系统地研究其在活细胞内和天然底物蛋白相互作用的机制，并阐明这些相互作用的生物学意义。对IbpB的初步研究结果显示，新的技术手段的确能帮助我们揭示IbpB在体内和天然底物蛋白作用的机制。

小分子热休克蛋白是一类重要的分子伴侣蛋白，在防止蛋白质聚集、促进蛋白质再折叠、保护细胞膜等方面发挥重要作用。但至今为止，对小分子热休克蛋白在活细胞中究竟如何发挥分子伴侣活性还知之甚少。本研究里，我们利用非天然氨基酸体内光交联的方法，系统地研究了大肠杆菌小分子热休克蛋白IbpB在活细胞中和天然底物蛋白相互作用的分子机制，系统地鉴定了IbpB在常温下和高温下分别为20个和48个底物结合氨基酸残基，并且发现这些结合底物的氨基酸残基并非预期主要是疏水氨基酸，事实上有将近一半残基是极性氨基酸，其中包含了13个带电氨基酸。 进一步，把IbpB的底物结合位点分为三类，分别在不同的温度下激活，其中部分位点在低温下参与寡聚化，但在高温下转为结合底物。考虑到IbpB在活细胞里结合底物蛋白的总量随着温度的升高而增加以及体外分子伴侣活性也随着温度升高而增加的现象，我们提出，IbpB可以多层次地温度依赖地激活自身的多个底物结合位点，从而成为一个鲁棒(robust)的分子伴侣蛋白，即“随温而变”。另外，我们还系统地鉴定了IbpB在常温和高温下分别结合的54个和95个天然底物蛋白（总计110个天然底物蛋白），对IbpB底物的多样性和选择性有了全新的认识：1）证明了IbpB的底物蛋白的多样性；2）首次发现IbpB在高温下对翻译相关的蛋白质具有极强的偏好性；3）首次发现IbpB在常温和高温对参与代谢的酶具有显著的偏好性；4）鉴定了敲除IbpB的大肠杆菌在热休克中更容易聚集的蛋白，其中有不少是翻译相关蛋白和代谢酶。这些研究深入揭示了小分子热休克蛋白的分子机理，提供了达到了课题的预期目标，相关工作成果发表在JBC上（Fu et al., J. Biol. Chem., 2013a, 2013b)。