副性腺蛋白调节家蚕交配繁殖行为研究

The extensive distribution of insect is attributed to its strong adaptability and powerful reproductive ability. So research results of the reproduction mechanism and mating behavior in insects will give directly supports of pest control and utility of economic insects. Accessory gland proteins as a main source of seminal fluid proteins function in regulation of spermatozoa fertilization. Bombyx mori Silkworm is an important economic insect, can docking research and product conversion section, expect of positive regulation and reverse inhibition to expand economy value of silkworm. So we focus on the function of accessory gland proteins in the female physiology regulation after mating and remating behavior. Using the Immunofluorescence, CRISPR/Cas9 technique and MT-scan method to elucidate their detail functions in ovulation, relating behavior, sperm storage and sperm competition. The research results will map the interaction network of key proteins in the reproduction mechanism of Lepidoptera insect. Comparing the features of mating behavior in silkworm and Drosophila, we hope to elucidate the theory of mating and reproduction behavior in insects, optimize target genes can benefit the utility of economic insects and control of pests.

昆虫种群分布扩张主要得益于其超强适应能力和旺盛生殖能力，研究生殖调控机理和繁殖行为将对害虫防治和益虫应用提供最直接的理论指导。副性腺蛋白在昆虫雄性生殖过程中的重要调节作用是保证交配后精卵结合、调节交配繁殖行为的关键环节。家蚕作为重要经济昆虫，可以对接基础研究成果和科创产品转化，对家蚕副性腺蛋白调节交配繁殖进行深入研究，将从正向调节和反向抑制的角度拓展家蚕的经济性状。我们结合免疫荧光定位分析、CRISPR/Cas9技术和MT-scan方法多角度、多层次的解析副性腺蛋白在家蚕交配后进入雌体内对雌性生理及行为变化的调节方式，阐明家蚕副性腺蛋白参与调节产卵量、改变雌性再次交配行为、精子储存和精子竞争等生殖行为的机制。综合分析家蚕和果蝇中副性腺蛋白调节交配繁殖行为的共性和差异，为全面理解昆虫交配繁殖行为提供理论依据，进而从中筛选对生殖干扰影响较大的靶点基因作为进一步益虫利用或害虫防治的切点。

昆虫是地球上种类最多、数量最大的动物类群，而且具有惊人的繁殖能力。昆虫生殖腺（Gonads）作为重要的内生殖器，分泌蛋白种类繁多且功能多样，不仅影响雄性昆虫的生殖能力，也影响雌性昆虫的生理过程和生殖行为。鳞翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二大目，其中家蚕（Bombyx mori）由于其良好的研究背景以及重要的经济意义而成为鳞翅目模式昆虫。以家蚕为对象来研究生殖腺分泌蛋白对交配繁殖的作用，有助于了解昆虫的生活过程及进化途径，相关研究结果不仅能应用于益虫利用，还能推广至害虫的遗传防治。本论文围绕家蚕生殖腺的转录组及其生殖腺特异性表达基因的功能开展研究，利用转基因CRISPR/Cas9技术分别构建雄性不育和雌性不育的家蚕突变品系，家蚕的生殖腺包括精巢（Testis，TE）、卵巢（Ovary，OV）和副性腺（Accessory gland，AG），针对雌雄两性不同又分为雄性副性腺（Male accessory gland，MAG）和雌性副性腺（Female accessory gland，FAG），而生殖腺内含多种与交配繁殖相关的分泌蛋白。本研究选取家蚕未交配成虫期的精巢、卵巢、雄性副性腺和雌性副性腺四个组织，分别进行了转录组测序（RNA-seq）。检测结果表明，精巢中表达的基因有9385个，卵巢中表达的基因有4552个，雄性副性腺中表达的基因有4054个，雌性副性腺中表达的基因有8205个，四个组织中都表达的基因有2923个；基因功能及代谢通路具有多样性，并以不同的方式精准调控生殖进程。Serine protease 2（Ser2）基因编码的蛋白是丝氨酸蛋白酶家族的一员，也是昆虫精液蛋白的重要成份且在进化上相对保守。利用CRISPR/Cas9技术敲除家蚕Ser2基因，发现Ser2基因突变导致家蚕雄性不育但雌性正常，且雄性不育表型可稳定遗传给后代。对精子束和精子进行染色，结果表明突变体中精子束和精子的形态与对照组相比并无显著性差异。对家蚕成虫交配5 h后产下的卵进行染色，对照组中可观察到在产卵0 h的精核和卵核，以及产卵5 h和10 h的卵裂现象；与突变体雄性交配后，染色结果中只能观察到卵核并没有卵裂现象。这些结果证明突变体精子形态正常但不能顺利入卵完成受精过程而导致雄性不育。