泛素蛋白酶体途径在中华绒螯蟹精子顶体反应中的功能

Ubiquitin Proteasome System (UPS) play important role in sperm maturation, acrosome reaction (AR), sperm-oocyto interaction during fertilization. Ubiquitination regulate the key proteins function in the sperm membrane, AR and sperm zona penetration, so it is important to focus on the function of UPS in reproduction of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Chinese mitten crab has the character of reproductive migration and sperm is multi-sperm interaction with one spawn but monospermy ultimately, sperm adheren spawn in vivo but fertiliztion in vitro. The special character of reproduction in mitten crab made them a good model for fertilization study. We based on the transcriptome of testis and ASG from E. sinensis identified 291 unigenes related to ubiquitin and 49 unigenes related to proteasom,that intrest us to study the function of UPS in sperm acrosome reaction in E. sinensis. We will use the well-established research system on UPS in mammal, such as the general antibody and all kinds of activators and inhibitors. Especially pay attention to the UPS regulation on key proteins, such as Vitelline coat protein, Acrosin, Sperm acrosomal protein, Fertilin, Prohibitin in sperm in E. sinensis. Applying RACE,Western Blotting and immunolocalization methods to analysis the regulation mechanism of UPS in capacitation and acrosome reaction in E.sinensis, that will accumulate molecular evidence to elucidate the mechnism of male reproduction of Chinese mitten crab.

模式生物中已经证实泛素蛋白酶体途径（UPS）在顶体反应和精卵融合过程中具有的重要作用。泛素化调节决定精子膜蛋白、顶体反应和精卵相互作用过程中关键蛋白的活性，因此关注泛素蛋白酶体途径在中华绒螯蟹生殖中的作用对我们进一步理解河蟹生殖机制具有重要意义。河蟹精子多精着卵、单精受精，以及体内着精、体外受精和群体生殖洄游的特点，使其成为研究生殖的最佳模型。基于河蟹精巢和副性腺转录组数据，从中发现291个泛素蛋白和49个蛋白酶体亚基基因，为全面了解生殖相关泛素蛋白酶体途径提供了基础数据，利用完善的泛素研究体系研究河蟹精子顶体反应和精卵相互作用过程中泛素蛋白酶体调节方式，重点关注精子受体蛋白、精子头粒蛋白、精子顶体蛋白、受精素、Prohibitin等在精子中通过UPS调控实现功能调节的蛋白，利用UPS途径专一性抑制剂处理精子分析上述蛋白在精卵相互作用过程中的功能，为阐明UPS在河蟹生殖中的功能积累分子证据

泛素蛋白酶体途径（UPS）在附睾内精子成熟、顶体反应和精卵融合过程中具有的重要作用。泛素化调节决定精子膜蛋白、顶体反应和精卵相互作用过程中关键蛋白的活性，因此关注泛素蛋白酶体途径在中华绒螯蟹生殖中的作用对我们进一步理解河蟹生殖机制具有重要意义。在本项目资助下我们全面分析泛素蛋白酶体途径关键作用因子在中华绒蟹生殖相关组织中的分布特征，结合基因组和转录组数据分析，采用分子克隆、精巢组织细胞培养、组织学分析、荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫印迹等多种分子学手段对中华绒螯蟹Cullin基因进行以下六个方面的研究: (1)通过H&E染色并显微镜下观察中华绒螯蟹精子发生不同时期的形态学并根据生殖细胞在生精小管占的优势比例将其进行分类；(2)成功构建中华绒螯蟹精巢组织细胞体外培养平台，观察精子形成的形态学变化；(3)本课题结合中华绒螯蟹的精巢转录组 (~2.31 Gb) 和基因组 (~ 439.3 Gb)，发现Cullin家族在中华绒螯蟹一共存在5个Cullin基因，分别是Cul1、Cul2、Cul3、Cul4 和Cul5，并获得cDNA全长进行组织表达模式、分子进化及保守性分析；(4) 进一步探究Cullin4如何调控中华绒螯蟹的精子发生过程，以增殖细胞核抗原 PCNA为内源性蛋白分子Marker来研究Cullin参与调控中华绒螯蟹的精子发生。研究发现Cul4 与 P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢发育不同时期的表达趋势一致，即在精母细胞期(八月)表达量最高，随着精子发育成熟而降低。.我们体外培养精巢组织细胞，然后通过添加NAE 酶抑制剂MLN4924来观察底物蛋白P21，P27蛋白的积累情况。同时研究了抑癌基因 P53、及研究已经证实的以Cul4为支架蛋白的CRLs泛素连接酶E3的特异性识别底物即细胞周期负调控因子P21和P27与Cul4的表达差异。我们通过添加浓度为1 μM/L NAE酶抑制剂MLN4924，发现细胞周期负调控因子P21在细胞培养36-48小时后，P27蛋白在24-36小时过程中都有较大程度的积累，相比对照组DMSO。 P53通过诱导不能修复的受损的生殖细胞凋亡来自发控制精子质量。P21、P27作为CRL4的底物蛋白随后会相应地被泛素化蛋白酶体途径降解，从而维持细胞周期的动态平衡。由此证明Cul4参与调控河蟹精子质量控制。