高山被孢霉ω-6/ω-3脂肪酸代谢流调控"分子开关"的分子改造及其机制研究

As a key commercial producer of ω-6 fatty acid, arachidonic acid (ARA), Mortierella alpina can also produce a little amount of ω-3 fatty acid,eicosapentaenoic acid (EPA).The key enzymes involved in ARA/EPA biosynthetic pathway are: Δ12 Des、ω3 Des、Δ6 Des、Δ6 Elo andΔ5 Des.Among which Δ6 Des and ω3 Des,located at the branch point of fatty acid metabolic flux,are key regulators of ω-6/ω-3 fatty acid metabolic flux.These two enzymes work together as a molecular switch that controlω-6/ω-3 metabolic flux. The molecular switch may regulate the metabolic flux through its activity and substrate preference, but up to present,molecular base of the function of the molecular switch is unclear. In this project, we will investigate the relationship between the structure and activity and substrate preference using saturated site-directed mutagenesis technique, and this will be further confirmed by in vivo study.We will also try to crystallize the Δ6 Des, and solve its crystal structure.If we can solve the structure of Δ6 Des, or other scientists may solve any membrane bound desaturase, then we can further explore the structure and function of the molecular switch。This work will provide technical support to develop an EPA or ω-6/ω-3 ratio balanced oil cell factorty, and will also provide insights into the biochemistry of differential production of ω-6 or ω-3 fatty acids in different microorganisms.

高山被孢霉是商业化生产ω-6脂肪酸ARA的重要菌种，但也能合成极少量的ω-3脂肪酸EPA。ARA/EPA合成通路由Δ12 Des、ω3 Des、Δ6 Des、Δ6 Elo和Δ5 Des组成。其中处于代谢流分支点的Δ6 Des和ω3 Des是调控ω-6/ω-3脂肪酸代谢流的"分子开关"。但我们对该分子开关如何通过其底物偏好性和活性来调节脂肪酸代谢流的分子机制还知之甚少。本课题将采用点饱和突变技术对分子开关进行分子改造，分析突变体的活性、底物偏好性与分子结构的相互关系；并通过体内实验对其进行功能验证；探索ω-6/ω-3脂肪酸代谢流的调控机制；最后构建高产EPA细胞工厂。本课题将为高山被孢霉工业化生产EPA或ω-6/ω-3比例为1:1的营养平衡的膳食油脂奠定技术基础，也将扩展我们对微生物选择性合成ω-6/ω-3 脂肪酸的生物化学基础的认识。

在PUFAs合成途径中，Δ6 Des和ω-3 Des是决定亚油酸分流而生成ω-6/ω-3 系列LC-PUFAs的分子开关，高山被孢霉内在的分子开关倾向于ω-6脂肪酸ARA的合成。本课题的研究目标是通过分子改造将高山被孢霉的分子开关转向ω-3脂肪酸EPA的生成。.本课题的研究内容包括：.采用基因同源比对、拓扑学分析等手段确定分子开关的底物结合域及活性中心，然后通过点饱和突变的方法对Δ6 Des和ω-3 Des进行分子改造，筛选偏好ω-3脂肪酸ALA的Δ6 Des，以及高效转化ω-6脂肪酸LA的ω-3 Des，解析脱饱和酶的活性、偏好性与蛋白质结构的相互关系，分析ω-6/ω-3脂肪酸代谢流调控的分子机制。最后将改造后的Δ6 Des、ω-3 Des整合到高山被孢霉基因组，进行功能验证，并构建高产EPA细胞工厂。.本课题取得的重要成果：.（1）采用ClustalW序列比对和拓扑学方法，分析了ω-3 Des的保守序列及结构域，并对ω-3 Des进行分子结构预测，确定了它的催化结构域及其影响底物结合或催化活性的氨基酸位点（A109、A116、A143、K148、T153、G339、S341、Q343）；查找并比对具有ω-6偏好性物种的Δ6 Des和具有ω-3偏好性物种的Δ6 Des的序列，确定了Δ6 Des的保守区域和潜在影响其底物偏好性的位点或区域。.（2）成功构建ω-3 Des的酿酒酵母表达系统并确定诱导表达最佳条件；.（3）分析并比较了高山被孢霉Δ6 Des和细小微胞藻Δ6 Des 的底物偏好性；.（4）分别将高山被孢霉的ω3脂肪酸脱饱和酶、细小微孢藻Δ6脱饱和酶在高山被孢霉中进行同源或异源表达，初步构建高产EPA细胞工厂。.本课题的主要科学意义：.本课题属于生物学中具有普遍性的科学问题，将扩展我们对微生物选择性合成不同系列PUFAs的生物化学机理的认识。其次，通过ω-6/ω-3脂肪酸代谢流分子开关的结构与功能分析，了解分子开关的调控机制，就可以通过分子改造的手段使微生物合成目标LC-PUFAs。本课题为构建高山被孢霉高产EPA细胞工厂奠定了技术基础，也为其他油脂微生物或植物的分子改造而生产特定LC-PUFAs或ω-6/ω-3比例平衡的理想膳食油脂打下坚实的理论基础。