柠檬酸转运体系在产脂真菌卷枝毛霉脂质积累中的作用及机制研究

As the end product of glycolysis, pyruvate is converted to acetyl-CoA when it is transported into the mitochondria of eukaryotic cells. However lipid synthesis happens in the cytosol, so only when acetyl-CoA is transported into the cytosol, then it can be used for lipid synthesis. Therefore, using citrate as the carrier, transport of acetyl-CoA from the mitochondria to the cytosol play a key role in regulating lipid biosynthesis. We have previously sequenced and analyzed the genome of Mucor circinelloides WJ11, and found that there are three related transporters for mitochondrial citrate transport: tricarboxylate transporter, citrate transporter and malate transporter. Our preliminary work on the malate transporter in Mucor cirnelloides CBS277.49 has shown that this transporter regulates the influx of malate into the mitochondria and lipid accumulation. However, the molecular mechanism of increasing citrate efflux from the mitochondria by malate transporter is unclear. In addition, no investigation has been carried out with the other two transporters. So, in this project, the identity and functions of the mitochondrial citrate transport system, and its role in lipid accumulation in this fungus will be fully investigated using genetic engineering,molecular biology and enzymological analysis. This work will provide new insights into the mechanism of mitochondrial citrate efflux and its association with lipid accumulation in oleaginous fungi, and lay a foundation for further three dimensional structure and function studies of key mitochondrial citrate transport proteins.

真核生物糖酵解终产物―丙酮酸进入线粒体并转化为乙酰-CoA，乙酰-CoA必须转运到细胞溶胶中，才能用于脂质合成。因此，乙酰-CoA以柠檬酸为载体从线粒体转运到细胞溶胶的途径是影响脂质合成的关键因素之一。本课题组前期研究解析了卷枝毛霉WJ11的基因组，发现卷枝毛霉存在三个线粒体柠檬酸转运相关蛋白质：三羧酸转运体、柠檬酸转运体、苹果酸转运体。前期研究发现苹果酸转运体调控苹果酸的转运，并直接影响卷枝毛霉脂质积累，但是该转运体如何促进线粒体柠檬酸向细胞溶胶转运的机制尚不明确，对其它两种转运体也未曾研究。本课题将通过基因工程、分子生物学、以及酶学分析等技术对卷枝毛霉线粒体柠檬酸转运体系进行功能分析，对该转运体系在脂质积累中的作用和相关机制进行深入研究。本课题的研究将提升我们对产脂真菌线粒体柠檬酸转出及其调控脂质积累机制的认识，为进一步深入解析线粒体柠檬酸转运关键蛋白质的三维结构与功能奠定基础。

在微生物脂质合成途径中，线粒体柠檬酸转运体系是决定线粒体中柠檬酸转出效率的关键步骤，决定了脂质合成中重要的前体物质乙酰辅酶A的合成。本课题的研究目标是针对卷枝毛霉的柠檬酸转运体系，研究其对脂质积累的作用与机制。 .本课题的研究内容包括: .对卷枝毛霉的基因组进行分析，找到编码线粒体柠檬酸转运体系的编码基因，对涉及的基因进行生物信息学分析，确定其潜在的生物学特性与作用。然后采用基因同源过表达和敲除的方法分析线粒体柠檬酸转运体系中各个转运体蛋白对卷枝毛霉脂质积累的影响。之后，通过异源表达卷枝毛霉三羧酸转运体相关基因，分离纯化出转运蛋白，在脂质体中研究其转运活性。最后，通过荧光素报告基因分析方法，分析转运体启动子的重要转录因子，进而探讨其对卷枝毛霉脂质积累可能的调控机制。.本课题取得的重要成果: .(1)分析了卷枝毛霉基因组，找到柠檬酸转运体系相关蛋白，采用ClustalW序列比对和拓扑学方法，分析了各个转运蛋白的保守序列、结构域及潜在生物学功能。 .(2)成功构建卷枝毛霉缺陷菌株和基因过表达系统并得到了柠檬酸转运体系各个基因的过表达菌株，分析了各转化子内脂质积累情况。.(3)成功构建卷枝毛霉柠檬酸转运体系各个基因的敲除菌株，分析了基因敲除对各转化子脂质积累的影响。.(4)对转运体的柠檬酸转运相关基因进行了双敲除，获得了sodit-a△mt、△mt△sodit-b、△sodit-a△sodit-b，并分析了分析了双基因敲除对卷枝毛霉脂质积累的影响，同时，构建了△mt△ct、△tct△mt、△ct△tct双基因敲除菌株。.(5)通过异源表达得到了柠檬酸转运体的纯蛋白，重组到脂质体中，分析测定了转运体的柠檬酸转运活性。..本课题的主要科学意义: 本课题属于生物学中具有普遍性的科学问题，将扩展我们对微生物脂质合成的生物化学机理的认识。其次，通过柠檬酸转运体系中各个转运体的结构与功能分析，了解脂质积累的调控机制，就可以通过分子改造的手段使微生物合成更多的脂质。本课题为构建卷枝毛霉高产微生物脂质细胞工厂奠定了技术基础，也为其他产脂微生物分子改造打下坚实的理论基础。 .