基于代谢组学的高山被孢霉产花生四烯酸代谢调控研究

工业微生物发酵过程中普遍存在基因背景不清晰，代谢途径复杂，发酵过程难调控等问题，其根本原因在于对细胞微观代谢的认识不够。代谢组学从代谢组层面搭建微生物微观信息和宏观表型的桥梁，为工业微生物的研究提供了新的视角。本项目以花生四烯酸（ARA）生产菌高山被孢霉（M. alpina）为研究对象，基于代谢组学理论获得M. alpina代谢组数据，通过对相同菌株不同培养环境下代谢组数据的横向对比以及高、低产菌株在相同培养环境下代谢组数据的纵向对比，确定与ARA产量相关的潜在生物标记物，结合生物标记物与ARA产量相关性的正、反双向验证手段，确定生物标记物与ARA产量的正、负相关性，建立多位点、多因素代谢调控模型，最终达到ARA高产，为实现多不饱和脂肪酸（PUFAs）在微生物体中的高效表达提供理论依据和新思路，也为工业微生物发酵调控提供简单直接、可控高效的方法和手段。

花生四烯酸（ARA）因其独特的生物学特性，被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。高山被孢霉（M. alpina）是发酵产ARA的工业生产菌株，存在着基因背景不清晰，代谢途径复杂及发酵过程难调控等问题。利用代谢组学技术可以从代谢组的微观层面解析微生物的宏观表型，为合理改造菌株及进行发酵调控提供指导。本项目利用代谢组学方法对ARA生产菌种和发酵过程控制中菌体的代谢特性等进行了研究。利用一种新的可视化方法（VM）首次对用于ARA生产的合成培养基组分进行了优化。基于GC-MS的分析检测建立了DB-5及DB-FFAP两种色谱柱分析的代谢物检测平台。创新性建立了一种常压下实现菌丝体快速过滤、再于液氮中淬灭并研磨的方法，用于M.alpin菌株的快速取样及代谢产物的提取。通过对高、低产菌株共有代谢物的统计学分析进行潜在生物标志物的筛选，用于反映菌体生物量及ARA的积累；通过标志物在发酵过程中的积累变化，最终确定了赖氨酸及丙氨酸与生产指标的正相关性；通过向培养基中添加赖氨酸进行发酵调控的验证，证实赖氨酸可以用于提高ARA的产量。通过高、低产菌株在相同培养环境下代谢组数据的纵向对比，发现其胞内代谢轮廓存在显著差异，低产菌株代谢物种类远多于高产菌株，说明低产菌株的合成代谢途径远比高产菌株复杂，进一步推断出高产菌株表现出的高生物量积累和高目标产物积累的表现型特性是由于其胞内代谢途径的简单匮乏所致。通过对高、低产菌株胞内代谢物的变化特征解析发现，高产菌株比原始菌株的TCA循环和EMP途径具有更高的代谢活力，说明诱变菌株胞内NADH和ATP代谢水平高于原始菌株，且胞内细胞膜代谢活力更活跃，这种变化可能有助于菌体适应环境变化，同时可能促进ARA油脂在膜上的合成。对相同菌株在不同供氧条件下的代谢组数据进行横向对比，将筛选出的关键代谢物回归相关的代谢通路，并将代谢物含量变化结合其生理功能进行分析，从而揭示出菌株通过降低自身代谢活力或激活旁路代谢来应对发酵体系溶氧不佳的情况，通过积累多元醇来调节渗透压和ARA合成过程中的氧化还原平衡，通过改变信号传导相关物质的代谢水平，激活重要的代谢通路来抵御氧化胁迫和应对环境变化，从而保证正常的菌体生长和油脂积累。研究结果为后续的发酵过程调控提供了依据，同时也为相关的多不饱和脂肪酸的微生物发酵生产提供了借鉴。