水貂肠炎病毒通过线粒体信号通路诱导宿主细胞凋亡的分子机制研究

Mink viral enteritis is the most prevalent and serious viral disease of mink caused by infection with mink enteritis virus. There is an urgent need for study of pathogenic mechanism of mink enteritis virus. Previous studies have shown that parvovirus non-structural proteins can induce host cell apoptosis and our study suggests that mink enteritis virus can induce host cell apoptosis in vivo and in vitro. In this study, construction of eukaryotic expression plasmid assay, cell transfection, DNA fragmentation assay, JC-1 staining flow cytometry, annexin V/PI double staining, morpholino antisense oligos inhibition, caspase activity assay, caspase inhibitors inhibition assays and laser confocal scanning microscope technique would be utilized separately to identify the role of mitochondrial signaling pathway in nonstructural protein 1 of mink enteritis virus-induced F81 apoptosis in the cellular and molecular level. We will clarify the expression and function of Bcl-2 family proteins, AIF, and ERK1/2 in NS1-induced mitochondrial apoptosis pathway. This study intends to clarify that the function and regulatory mechanism of mitochondrial signaling pathway in nonstructural protein 1 of mink enteritis virus-induced apoptosis, which provides the solid foundation for further investigation of the pathogenic mechanism of mink enteritis virus, and the design of new type vaccines.

水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎病毒引起的危害水貂最为严重的病毒性传染病，迫切需要加强对水貂肠炎病毒感染致病机制的研究。水貂肠炎病毒属于细小病毒科，研究表明细小病毒非结构蛋白具有诱导宿主细胞凋亡的能力，我们研究发现水貂肠炎病毒非结构蛋白NS1能够诱导细胞凋亡。本研究旨在通过真核表达质粒构建、细胞转染、DNA片段化检测、JC-1染色流式细胞术、Annexin V/PI双染色法、Morpholino反义核苷酸抑制实验、Caspase活性/抑制实验和激光共聚焦显微镜技术等实验手段，从细胞和分子水平探讨线粒体信号通路在水貂肠炎病毒 NS1蛋白诱导F81细胞凋亡中的作用，阐明Bcl-2家族蛋白和AIF在NS1诱导细胞线粒体凋亡通路的调控作用及其上游ERK1/2表达变化及作用，探明水貂肠炎病毒 NS1蛋白诱导宿主细胞凋亡的作用与调控机制，为进一步揭示水貂肠炎病毒的致病机理和新型疫苗设计奠定理论基础。

水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus, MEV）引起的水貂病毒性肠炎是水貂养殖业的主要疫病之一。本研究阐述了MEV及其NS1蛋白诱导细胞凋亡的信号途径及其作用机制，完成了以下试验：（1）MEV在体内、体外均能诱导细胞凋亡的发生。我们采用MEVB细胞毒感染健康的水貂，发现消化道组织出现不同程度的病理变化，其中食管、小肠、肠系膜淋巴结和肾脏中发生了细胞凋亡，与对照组差异显著。体外方面研究发现MEVB感染F81细胞后，能显著抑制细胞的生长，导致细胞在G1期的积累，诱导细胞凋亡的发生。（2）MEV NS1蛋白能够诱导细胞凋亡，而NS2、VP1和VP2蛋白不具有诱导细胞凋亡的能力。我们分别构建MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒，转染到F81和HEK293T细胞，结果表明NS1能显著抑制F81和HEK293T细胞活性，对细胞产生毒性反应，而VP1和VP2不具有上述作用。利用流式细胞术检测NS1、NS2、VP1和VP2对细胞周期和细胞凋亡情况的影响，结果显示NS1能导致F81和HEK293T细胞周期阻滞在G1期，同时采用Annexin V-FITC/PI检测发现，NS1能诱导细胞凋亡的发生。进一步研究发现MEV NS1能导致细胞核呈现碎块状致密浓染、并且能产生DNA Ladder现象，电镜发现染色质浓缩，细胞核凝聚，产生凋亡小体。（3）完整的NS1蛋白能够通过线粒体信号通路诱导细胞凋亡。我们采用截短表达和定点突变两种策略，分别对NS1起始结合/核酸内切酶区域、解旋酶活性区域和 C端反式激活区域三个结构域单独表达和不同结构域的关键位点进行点突变，结果发现只有完整的NS1具有诱导细胞凋亡的能力。NS1能降低线粒体膜电位、提高线粒体膜通透性，释放Cyt C进入细胞质中，激活Caspase-9和Caspase-3；同时发现NS1促进Bax从胞浆中转位进入线粒体，能使Bax/Bcl-2比值升高，Bcl-2 （Ser 70）磷酸化，导致细胞内ROS积累，激活了p38 MAPK和p53，p38 MAPK（Thr 180/Tyr 182）和p53（Ser 15/20）发生磷酸化，从而介导线粒体信号凋亡通路。综上研究表明，MEV诱导细胞凋亡是通过其NS1蛋白激活p38 MAPK和p53介导的线粒体信号通路，为揭示MEV引起水貂致病机理奠定理论基础。