氨基酸激活Annexin A2调节乳腺上皮细胞增殖及乳蛋白合成的分子机理

Annexin A2 (AnxA2), a membrane binding protein, contains phosphorylation sites and proteolysis sites in its N terminal, which has been shown to play multiple biological roles in proliferation, transportation and metabolism. However, the regulatory mechanism and signaling pathway of AnxA2 still needst to be further characterized. Our research group previously found that AnxA2, exhibiting two molecular forms of 36 kD and 33 kD, could mediate the signal of amino acids and affect cell proliferation and milk protein synthesis of bovine mammary epithelial cell (BMEC). In this research, we firstly verify the effects on cellular signal transduction pathways to cell proliferation and milk protein sythesis. Site mutation and subcellular localization are used to analyze the phosphorylation sites, proteolysis sites and the migration of the two forms of AnxA2. siRNA, Co-IP and PI3K inhibitor are used to determine AnxA2 regulating downstream signaling pathway mediated by PI3K. And siRNA of GPCRs, PKCα, MMP9 and MMP10 are used to confirm the roles of these moleculars in the activation of AnxA2 by amino acids. Taken together, the aim of this project is to elucidate molecular mechanism of AnxA2 mediating amino acids signal and modulating signaling pathway related to cell proliferation and milk protein synthesis.

膜联蛋白A2（Annexin A2，AnxA2）是膜结合蛋白，其N端包含磷酸化位点和水解酶作用位点，具有调控细胞增殖、物质转运、代谢等功能，但其作用机理和信号途径尚待深入研究。本课题组前期发现AnxA2有36 kD和33 kD两种分子形式，且能介导氨基酸信号促进牛乳腺上皮细胞（BMEC）的增殖和乳蛋白合成。本研究拟利用过表达和siRNA确定AnxA2对细胞增殖和乳蛋白合成信号途径的影响；利用点突变和亚细胞定位确定AnxA2的磷酸化和水解位点及两种分子形式的亚细胞定位变化；利用siRNA、Co-IP和激酶抑制剂确定PLA2、PI3K和/或CDC42/Rac1对AnxA2调节功能的介导作用；利用GPCRs、PKCα、MMP9和MMP10的siRNA确定氨基酸活化AnxA2的信号通路。本工作将揭示AnxA2介导氨基酸促进BMEC增殖和乳蛋白合成的信号途径和分子机制。

乳中含有大量的优质蛋白质、脂类等物质。乳腺上皮细胞（mammary epithelial cell，MEC）是泌乳的最基本的结构和功能单位，通过开展MEC泌乳机理的研究，将为建立高效的泌乳调控提供理论依据和技术途径。膜联蛋白A2（Annexin A2，AnxA2）是膜结合蛋白，其N端包含磷酸化位点和水解酶作用位点，具有调控细胞增殖、物质转运、代谢等功能，但其作用机理和信号途径尚待深入研究。. 本项目的主要研究内容是：①揭示Annexin A2调节MEC增殖和乳蛋白合成的信号转导途径；②揭示氨基酸激活Annexin A2的信号途径；③揭示Annexin A2磷酸化和限制性蛋白水解在其功能中的作用。. 本课题组通过基因过表达和基因干扰试验分析细胞数量、细胞周期进程、细胞的乳蛋白的合成量，确定Annexin A2正向调节MEC增殖能力和乳蛋白合成；通过分析过表达MEC中细胞增殖相关的Cyclin D1和乳蛋白合成相关的磷酸化mTOR的蛋白表达量变化，确定Annexin A2正向调节细胞增殖和乳蛋白合成相关的mTOR和Cyclin D1信号途径；通过氨基酸处理和Annexin A2 siRNA试验分析以上信号分子的蛋白表达量变化，确定氨基酸可以通过Annexin A2磷酸化的介导调节细胞蛋白质合成及mTOR信号通路；进一步通过Co-IP实验确认Annexin A2结合p-PKCα，并通过氨基酸处理和PKCα siRNA揭示PKCα位于Annexin A2的上游，能够介导氨基酸调节Annexin A2磷酸化；研究过程中同时发现氨基酸促进Annexin A2磷酸化及Annexin A2-33kD截短片段的形成，并通过点突变试验确定了Ser25位点磷酸化是其发挥功能的活化形式。. 综合以上研究结果，本项目揭示了Annexin A2通过PI3K/mTOR信号通路调节细胞增殖和乳蛋白合成，确定了Annexin A2在Ser25位点的磷酸化是其调控作用所必需的，明确了氨基酸通过PKCα激活Annexin A2磷酸化进而促进细胞增殖和乳蛋白合成的信号转导途径。此结果有助于进一步阐明乳腺发育与泌乳调控的分子机制，具有重要的科学研究和生产实际意义。