奶山羊乳腺上皮细胞EGFR调控甘油三酯与乳铁蛋白合成的分子机理研究

The project is going through the methods (Microexamination, Western blot, Real-time quantitative PCR, CCK, Immunofluorescence, Flow cytometry, transcriptome sequencing, gas chromatography-mass spectrometry and so on) with goat mammary gland epithelial cells as experimental object. To begin with, the biological characteristics of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene are analyzed. Then, the effects of EGFR gene on cell structure, proliferation and cycle of dairy goat mammary gland epithelial cells are detected. Total mRNAs of goat mammary gland epithelial cells with EGFR gene overexpression or silencing are extracted to analyze the transcriptome changes. Employing EGF, AG1478, LY294002, U0126 and U73122, the activities and relationships of MAPK, PI3K/akt and PLC-γ1 pathways in mammary gland epithelial cells are investigated. And furthermore, the molecular pathways of EGFR regulating the synthesis of triacylglycerol and lactoferrin are studied. The research will certify the regulation mechanisms of EGFR-mediated signaling pathways to milk fat and proteins in theory, and the results of which provide new considerations for improving milk quality and dairy goat breeding and so on.

本课题以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象，采用显微观察、Western blot、RT-qPCR、CCK、免疫荧光、流式细胞仪、转录组测序、气相色谱-质谱联用等技术，分析羊表皮生长因子受体（EGFR）基因生物学特性；检测EGFR基因对羊乳腺上皮细胞结构、细胞增殖及细胞周期的影响。提取乳腺上皮细胞总RNA，分析在EGFR基因超表达或沉默后乳腺上皮细胞转录组变化。借用EGF、AG1478、LY294002、U0126、U73122，分析EGFR蛋白介导的MAPK、PI3K/akt、PLC-γ1信号通路活性及其相互关系，进一步研究EGFR调控甘油三酯及乳铁蛋白合成的分子途径。该研究将从理论上明确EGFR通过所介导的特异信号通路以调控乳脂及乳蛋白代谢，获得的研究成果将对于提高羊乳品质以及培育优质奶山羊品种等提供新思路。

动物乳中脂肪酸种类丰富，尤其是短、中链脂肪酸对人体有益，但脂肪酸的含量较低。通过提高乳脂在羊乳中的占比，就能改善羊乳的营养价值和带来更高的经济效益。表皮生长因子受体是细胞表面广泛分布的跨膜酪氨酸激酶受体，EGFR信号通路能促进细胞增殖与分化，调节组织的发育和稳态。本课题以西农萨能奶山羊为研究对象，采用Western blot、细胞免疫荧光、实时定量PCR、气相色谱-质谱联用、高通量测序等试验技术，通过分离培养奶山羊原代乳腺上皮细胞，分析EGFR对奶山羊乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响、参与PI3K/akt、MEK/ERK1/2以及PLC-γ1信号通路的调控，以及对奶山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢的影响，同时通过抑制剂、EGF添加等手段分析EGFR对乳脂合成的影响机制，解析EGFR通过PLC-γ1、PI3K/akt信号通路调控脂肪酸合成的分子机制。本项目首先分离获得了奶山羊乳腺上皮细胞，通过EGF、EGFR基因相关试验研究证实EGFR/PLC-γ1和Akt信号通路可显著参与脂肪酸代谢相关基因并导致细胞内甘油三脂的变化；同时证实EGFR/Akt以及ERK1/2信号通路影响细胞周期变化并显著促进细胞周期蛋白CDK2和细胞周期蛋白的表达，这些生理过程均归于EGFR对Akt、MAPK/ERK1/2以及PLC-γ1信号通路的影响，与此同时发现EGFR可能参与乳铁蛋白的调控，并进一步分析了乳铁蛋白的转录调控机制。以上研究结果为改善羊乳品质及培育优质奶山羊品种奠定研究基础。