支链氨基酸调控猪乳腺上皮细胞乳蛋白和防御肽的表达及机制

Milk secreted by mammary gland can be an important index to judge the nutrition condition of lactating sows, and are also the full nutritional source of newborn piglets. Therefore, it is the key to get qualified and quantified milk with strong immunity. It was demonstrated in vivo that branched-chain amino acid (BCAA) has the potential to modulate the synthesis of milk protein and expression of host defense peptides. But until now no data are shown about the regulation of BCAA on porcine mammary epithelial cells in vitro. This study investigate the effect of BCAA on proliferation, amino acids membrane carrier, tansmembrane resistance, milk protein synthesis, protein turnover, and host defense peptides expression of porcine mammary epithelial cells by the methods involved cell culture, isotope tracing, western blot, and real-time PCR. The role of mTOR signaling pathway and ERK signaling pathway will be separately illustrated in the regulation of milk protein synthesis and host defense peptides expression. The study will provide important guidance for the use of BCAA on the nutritional regulation of lactating sows.

乳汁是衡量泌乳母猪营养的重要标准，也是初生仔猪营养的全部来源。因此，获得足量、优质、免疫力强的乳汁至关重要。体内研究表明，支链氨基酸(BCAA)具有促进乳蛋白分泌和宿主防御肽表达的调控作用，但在体外研究BCAA对猪乳腺上皮细胞的调控及其机制还鲜见报道。本研究以猪乳腺上皮细胞为模型，通过细胞培养、同位素示踪、Western blot、Real-time PCR等技术手段，探讨BCAA对猪乳腺上皮细胞的增殖、氨基酸跨膜载体、细胞跨膜电阻、乳蛋白合成、蛋白质周转、宿主防御肽表达的影响，以探明BCAA对猪乳腺上皮细胞的调控效应；通过检测信号通路重要激酶磷酸化水平，并结合使用信号通路抑制剂，明确mTOR信号通路在BCAA调控乳蛋白合成中的地位，分析ERK通路在BCAA调控宿主防御肽表达中的作用。通过本试验研究，为BCAA在泌乳母猪的营养调控和转化提供理论依据和指导。

在养殖生产中，乳汁的质量不仅是衡量哺乳母猪营养状况的重要指标，更是新生仔猪的唯一营养来源。乳汁中的蛋白质含量丰富，有助于提升出生仔猪的健康状况，增加仔猪的个体重和窝重，提高仔猪的成活率，从而直接影响到养殖业的经济效益和养殖者的积极性。因此，提高母猪产奶的质量是行业关注的热点，促进乳蛋白合成及其调控机制也是动物营养领域的重要研究课题。亮氨酸不但是动物生长所需要的必需氨基酸，近年来发现其具有多种生物学功能，在营养和代谢调控方面尤其是泌乳营养调控方面具有新的开发价值。本试验以猪乳腺上皮细胞(PMEC)为模型，通过细胞培养、Western blot、ELISA等试验技术和方法，检测亮氨酸对猪乳腺上皮细胞生长增殖率和酪蛋白合成的影响，分析亮氨酸通过mTOR信号通路调控乳蛋白分泌的分子机制。结果显示，添加亮氨酸显著提高PMEC的相对生长率(P<0.05)。浓度从0 mmol/L增加到1 mmol/L，相对生长率随剂量的增加呈依赖性增长。添加亮氨酸能够显著提高mTOR信号通路的关键蛋白mTOR，p70S6K和4EBP1的磷酸化丰度(P<0.05)，在1 mmol/L时，mTOR，p70S6K和4EBP1磷酸化蛋白表达达到最高水平。添加亮氨酸能够显著增强猪乳中主要酪蛋白包括αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和k-酪蛋白的表达量，表明亮氨酸促进酪蛋白的分泌。添加雷帕霉素显著抑制了PMEC的相对生长率(P<0.05)，并抑制mTOR信号通路，而继续添加亮氨酸没有显著增加酪蛋白的分泌，表明亮氨酸是通过mTOR信号通路介导调控乳蛋白分泌的。总之，通过本研究发现，亮氨酸通过mTOR信号通路促进猪乳腺上皮细胞酪蛋白的分泌，这为亮氨酸调控泌乳母猪的产奶量提供理论依据，对于开发新型的饲料添加剂和拓展氨基酸的生物学意义具有重要的参考价值。