CD73诱导乳腺癌上皮-间质转换(EMT)的作用及机制研究

乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤之首,转移是其致死的主要原因。上皮-间质转化(EMT)是乳腺癌转移的重要生物学过程,研究其EMT的调控机制具有重要意义。TGF-β激活Smad诱导EMT是其主要信号通路。本组前期研究表明，CD73促进乳腺癌转移，并上调Smad活性。因而假设CD73通过TGF-β/Smad通路诱导EMT从而促进转移。本课题拟首先利用乳腺癌组织芯片,检测肿瘤细胞及间质成纤维细胞CD73的表达与上皮标志物(E-cadherin、α-catenin)、间叶标志物(N-cadherin、Vimentin)表达的相关性。其次研究乳腺癌细胞株CD73表达变化能否调控其EMT发生、干性获得及与荷瘤小鼠乳腺癌肺转移的关系，并探讨TGF-β/Smad通路的作用。最后,培养野生型及CD73敲基因小鼠胚胎成纤维细胞, 体内外实验观察其与乳腺癌细胞的相互作用。本课题将为防治乳腺癌转移提供新靶点及实验依据。

寻找新的乳腺癌的诊疗靶点对乳腺癌防治具有重要意义。CD73是一种通过糖基-磷脂酰肌醇（GPI）锚定于质膜的糖蛋白，其主要功能是水解胞外AMP生成腺苷。本课题组前期研究发现CD73显著促进乳腺癌的生长和转移，然而，CD73的作用机制仍未阐明。信号传导途径异常是成为许多细胞恶变的重要因素。AKT/GSK-3β/β-catenin介导的信号传导是对细胞生存生长至关重要的多条分子信号通路的共同途径，在乳腺癌和其他肿瘤中多表现为异常激活。“肿瘤干细胞”假说和肿瘤的“上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）”理论的研究在乳腺癌发病机制的研究中日益受到重视。. 本研究包括:首先，分别构建了CD73干扰和过表达的慢病毒载体，并感染乳腺癌细胞验证其效果。其次，利用细胞计数（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和克隆形成实验等观察CD73对乳腺癌细胞和乳腺细胞体外增殖的影响，利用流式细胞仪检测观察CD73对乳腺癌细胞和乳腺细胞的细胞周期的影响、利用Akt特异性抑制剂MK-2206等研究了CD73与AKT/GSK-3β/β-catenin信号传导途径的关系。再次，利用流式细胞仪检测各种乳腺癌细胞株中乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）和CD44＋CD24－等乳腺癌干细胞标志物的分布情况，并检测CD73干扰和过表达前后乳腺癌干细胞标志物的变化，接下来利用悬浮球培养法富集了乳腺癌细胞株中的干细胞，并利用实时PCR和WesternBlot检测乳腺癌干细胞球相对于正常培养细胞株中CD73表达变化。利用转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）成功诱导乳腺细胞株MCF10A发生了EMT，发现CD73与EMT密切相关的重要信号分子EGFR有重要相互调控作用，并促进血管新生。. 结论：CD73可以通过AKT/GSK-3β/β-catenin/ cyclinD1信号传导途径促进乳腺癌细胞和乳腺细胞体外增殖；CD73可在乳腺癌干细胞中表达增高，并可提高乳腺癌细胞中干细胞亚群的比例；CD73 在TGF-β诱导乳腺细胞发生的EMT中表达增加，与EGFR和血管新生相关，提示CD73参与该过程。