基于血管细胞保护作用的大米α-球蛋白肽抗动脉粥样硬化机制研究

The anti-atherosclerotic role of rice α-globulin has been proved in our previous study, but the key fragments of peptides after gastrointestinal digestion and absorption remains unclear. Although it has been confirmed that the prevention of α-globulin did not performed by regulating lipid metabolism or preventing inflammation, its exact mechanism still need to be further studied, namely, whether α-globulin performed by protecting vascular cells, one of the most important anti-atherosclerotic mechanisms except the two ways mentioned above. This present project focus on: ① study on the in vivo digestion and absorption characteristics of α-globulin by the in vitro stimulation of digestion and intestinal sac eversion; ② study on the cytoprotective effects of the extracts of different peptides fractions obtained from the absorbed solution in intestine on oxidized low-density lipoprotein-induced human umbilical vein endothelial cells and vascular smooth muscle cells in vascular injury model, so as to isolate and purify the significantly bioactive components; ③ the chemical synthesis of peptide monomers based on the measurement of the amino acid composition and sequence of obtained peptides components, and the evaluation of their bioactivities in injury model; ④ investigation of the effects of peptide monomers on the metabolic factors in injury model of cells, in order to clarify the bioactive peptides fragments and their anti-atherosclerotic mechanism based on the protective effects on vascular cells. The project will provide a scientific basis for the preparation of bioactive peptides by extraction or biosynthesis and the application of bioactive peptides.

大米α-球蛋白的抗动脉粥样硬化(AS)作用已在我们前期研究中证实，但其能够被胃肠道消化吸收并发挥功效的关键肽段尚不明确。三个主要的抗AS机制中，由前期的研究已经排除了调节脂质代谢紊乱和抑制炎症反应。但是否就是通过另一个，即血管细胞保护作用发挥功效仍有待于进一步研究。本项目拟通过：①模拟体外消化和肠囊外翻法研究α-球蛋白在机体内的消化吸收；②从小肠吸收液中分离纯化出不同的肽组分，研究其在氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞、血管平滑肌细胞损伤模型中的细胞损伤保护效果，从中筛选具有显著活性的肽组分；③解析组分中肽的氨基酸组成和序列后化学合成肽单体，并在损伤模型中验证其功效；④考察肽单体对细胞损伤模型中各代谢因子的影响并解明作用途径，从而确定α-球蛋白抗AS的关键肽段并阐明其基于血管保护作用的抗AS机制。项目将为大量提取制备或合成抗AS功能肽及其应用提供科学依据。

我们前期研究中证实了大米α-球蛋白（100 mg/kg体重/天）的抗动脉粥样硬化（AS）作用，但其能够被胃肠道消化吸收并发挥功效的关键肽段尚不明确。三个主要的抗AS机制中，由前期的研究已经排除了调节脂质代谢紊乱和抑制炎症反应。但是否就是通过另一个，即血管细胞保护作用发挥功效仍有待于进一步研究。本项目采用外翻肠囊法收集大米α-球蛋白经体外消化产物中可吸收组分，利用凝胶色谱和半制备高效液相色谱分离纯化，液相质谱串联测定氨基酸序列（YYGGEGSSSEQG、GEQQQQPGM、YGEGSSEEG、AAGALPS、SESEM）。为了验证肽的降血脂功效灌胃100 mg/kg体重/天的剂量灌胃金黄地鼠30天后分析了脂质指标。结果显示降低了血清的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇以及动脉硬化指数的水平。进而探讨了5种肽对于肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的血管内皮细胞损伤的影响。确定了10 ng/mL的TNF-α处理浓度的基础上运用50 μg/mL浓度下的肽来处理细胞后测定了细胞的氧化应激和炎症反应。结果显示肽可以显著增加细胞损伤引起的活性下降，有效调节炎症因子（MCP-1）及细胞粘附因子的水平（ICAM-1，VCAM-1），且对氧化应激因子NO，iNOS, MDA, ROS，GSH-Px和SOD水平有改善作用。 进一步分析了核蛋白p65的转运、表达以及上下游信号因子（IKKα、IκB、Bcl-2、Bax、p-p38）的表达水平，结果显示肽通过NF-κB信号通路发挥作用。VSMC增值迁移的结果显示YYGGEGSSSEQG、SESEM号肽可有效抑制VSMC的增值迁移。蛋白质印迹实验结果表明肽可下调血小板源生长因子PDGF-BB，这是其抑制VSMC增值迁移的关键。将YYGGEGSSSEQG、SESEM（10 mg/kg体重/天）灌胃给ApoE-/-小鼠三个月。结果显示YYGGEGSSSEQG、SESEM肽可显著减小ApoE-/-小鼠主动脉的动脉粥样硬化（AS）斑块面积，并显著降低ApoE-/-小鼠血清GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶水平以及VCAM-1水平。以上结果表明：肽通过血管细胞保护作用发挥抗AS作用。项目将为大量提取制备或合成抗AS功能肽及其应用提供科学依据。