大米抗氧化肽对内皮细胞氧化损伤的保护作用及其机制研究

Oxidative damage will change the structure and function of cells, influence the body's health, and then cause various vascular diseases and senility. Endothelial cell with oxidative damage has been demonstrated to be an important risk factor for the development of vascular diseases. Supplying natural antioxidant can help the body resisting oxidative damage, anti-aging and preventing vascular diseases. We have isolated and purified the antioxidant peptide(AP)from the rice protein, which including 13 amino acids. AP showed strong scavenging activities of DPPH radical and ABTS. In the oxidative stress cell model, the preliminary results showed that AP could protect endothelial cells from apoptosis. For further research on the protective mechanism of rice antioxidant peptide, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) would be used as an oxidative stress cell model for in vitro tests, by using transmission electron microscopy analysis, flow cytometry assay, immunofluorescence, DNA laddering assay, angiogenesis experiments, protein chip, siRNA and other technologies. This study will reveal the protective mechanism of rice antioxidant peptides from the cell-protein-gene 3 levels, also provide useful tips and solid theoretical basis for the development of functional food that using rice antioxidant peptides as the raw meterial.

氧化损伤会改变细胞的结构和功能,影响机体健康,从而引发多种血管类疾病与早衰。血管类疾病发生的关键因素之一就是内皮细胞发生氧化损伤。通过补充天然抗氧化剂可以帮助机体抵御氧化损伤,延缓衰老和预防血管类疾病的发生。本课题组成功从大米蛋白中分离纯化得到了一段含有13个氨基酸的抗氧化肽,通过总抗氧化能力和自由基清除率的测定验证了其抗氧化活性。在氧化损伤的内皮细胞模型中,相对存活率、凋亡率和氧化损伤敏感因子检测的预实验也表明了大米抗氧化肽的氧化损伤保护功能。为了进一步研究大米抗氧化肽的氧化损伤保护机制,我们拟分离培养人原代脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),构建原代HUVEC氧化损伤模型，应用透射电镜、流式细胞术、免疫荧光、DNA片段化检测、血管生成实验、蛋白质芯片、siRNA等技术,从细胞-蛋白质-基因三个层面揭示抗氧化肽的保护作用机制,为以大米抗氧化肽为原料的功能性食品的开发提供有益提示和理论依据。

氧化损伤会改变细胞的结构和功能，影响机体健康，从而引发多种血管类疾病与早衰。血管类疾病发生的关键因素之一就是内皮细胞发生氧化损伤。通过补充天然抗氧化剂可以帮助机体抵御氧化损伤，延缓衰老和预防血管类疾病的发生。本课题组成功从大米蛋白中分离纯化得到了一段含有11个氨基酸的多肽。本项目正是在生化水平验证了这一多肽活性的基础上，通过细胞、蛋白、分子三个水平来研究其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的氧化损伤保护作用，并深入分析大米抗氧化肽(Rice Antioxidant Peptides，RAP)的抗氧化作用机制。本项目利用H2O2构建体外氧化损伤模型，通过生长曲线、流式细胞术、凋亡染色等检测分析了细胞的存活率、凋亡率等；利用光镜、电镜、荧光显微镜观察细胞形态和超微结构的变化；进而通过彗星实验检测了DNA的损伤程度，血管形成实验检测了细胞的迁移和运动能力变化；并通过QPCR检测调控信号通路的关键基因mRNA水平的变化；最后通过Western blot检测细胞相关凋亡因子NF-κB在损伤前后的表达变化，进一步说明RAP对氧化损伤HUVEC的保护作用及作用机制。. 实验结果显示，RAP对H2O2氧化损伤的HUVEC生存活力有显著影响，MTT筛选出RAP在0.3 mg/mL下作用24 h对HUVEC的保护作用最佳，相较于天然抗氧化物Vc其抗氧化活性相差不大；光镜和电镜观察结果显示RAP保护组细胞形态与正常对照组相似，细胞结构完整，细胞形态规则且伸展良好，细胞器饱满、丰富，细胞表面平滑；损伤组细胞形态不规则，核膜内陷，核质外溢，细胞器形态不规则，细胞处于损伤状态；流式检测结果表明RAP保护组相较于氧化损伤组其保护率达60%以上。血管形成实验表明RAP保护组可以形成形状规则的中空微管束，氧化损伤组则不能。QPCR、Western Blot结果显示RAP能下调由H2O2引起的HUVEC细胞中NF-κB的表达，通过抑制HUVEC的凋亡对HUVEC起到保护作用。. 研究结果表明RAP可以有效抑制氧化损伤HUVEC细胞的损伤程度，提高HUVEC细胞的生存活力，下调细胞相关凋亡因子NF-κB蛋白的表达，RAP从细胞到分子水平均表现出良好的氧化活性。通过本项目的研究，可为大米活性肽的后期深入开发利用提供强有力的理论支撑，并为以大米抗氧化肽为原料的功能性食品的开发提供有益提示和理论依据。