Calcineurin/NFAT信号通路在alpha-synuclein所致多巴胺能神经元损伤中的作用及其相应的药物干预

Parkinson's disease (PD) is pathologically characterized by a preferential loss of midbrain dopaminergic neurons and the presence of α-synuclein-positive intracytoplasmic inclusions named Lewy bodies (LBs). Whereas both missense and multiplication mutaions of α-synuclein cause the early-onset autosomal dominant familial forms of PD, the α-synuclein gene locus also associates with the common sporadic PD. Together, these data point out a prominent role of α-synuclein in the pathogenesis of PD. However, the molecular pathogenic processes by which α-synuclein causes the degeneration of midbrain dopaminergic neurons remains elusive. Our recent results show that calcineurin/NFAT signaling pathway plays an important role on dopaminergic dysfunction. The present study is to systematically investigate the CN/NFAT pathway in α-synuclein-dependent neuron loss using transfected cells and A53T double transgenic mice. This new target may be useful for screening and testing new PD therapeutic drugs.

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种以黑质纹状体通路的病变为主要特征的神经退行性疾病。PD两个主要的病理学特征，一是中脑黑质致密部（SNC）多巴胺能神经元的丧失；二是SNC区域发现的称为路易体（ LBs）的包涵体。研究发现，α-synuclein蛋白是组成LBs的主要成分。遗传学研究结果显示编码α-synuclein的SNCA基因突变导致的氨基酸突变，如A53T或该基因染色体座位三倍扩增等都与家族性PD的发病有着直接关系。我们课题组实验研究和文献调研发现，钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CN）/NFAT信号通路在PD神经元存活中发挥重要作用。本课题将利用过表达野生型以及突变型A53Tα-synuclein的细胞以及A53T小鼠研究CN/NFAT信号通路在PD多巴胺能神经元丢失中的作用机制，并利用我们实验室前期已经筛选得到的药物进行干预，寻找新的药物靶点。

帕金森病人的一个典型病例特征是α-synuclein的过度表达和中脑多巴胺能神经元的丢失，但是确切机制并不是很清楚。我们这个项目主要是研究了钙调磷酸酶（calcineurin, CN）信号通路与α-synuclein之间的相互关系。转染了α-synuclein以及其突变体A53T α-synuclein的细胞中CN活力提高，CN下游转录因子NFATc1和NFATc3有明显的入核行为；利用A53T α-synuclein转基因的小鼠脑组织发现，过表达α-synuclein能够引起NFATc3的入核行为，表现为细胞质中NFATc3减少，核内NFATc3增多。免疫荧光发现，TH positive的多巴胺能神经元细胞中，核内NFATc3的染色明显增加。我们利用CN的抑制剂环孢菌素A（CsA）孵育体外培养的多巴胺能神经元，发现CN的抑制可以阻断α-synuclein过表达所引起的细胞死亡。这说明，CN/NFAT依赖的信号通路确实在α-synuclein引起的多巴胺能神经元丢失中发挥重要作用。我们在体外进行了α-synuclein与CN的相互作用研究：纯化α-synuclein、CN蛋白，通过微量热涌动（MST）方法发现，两者能够相互结合；通过CN活力测定方法，发现α-synuclein能够激活CN活力；在正常和过表达α-synuclein的HEK293细胞内，通过免疫共沉淀实验（co-ip）发现，两者能够相互作用，且这种相互作用受到钙和钙调素的影响。因此，我们体内外的实验都证实了α-synuclein的过表达能够引起CN/NFAT信号通路的变化。. 我们又研究了CN与NFAT等靶蛋白的相互作用，以期通过破坏蛋白-蛋白相互作用来阻断该信号通路。其中包括CN的内源调节因子（RCAN1）和转录因子EB（TFEB），研究CN与它们的两个结合基序之间的相互作用。我们发现，槲皮素能够破坏CN与LxVP序列之间的相互作用。随后的细胞实验发现，它也能阻断CN/NFAT信号通路的下游基因表达。因此，我们可以通过肽类以及小分子化合物破坏两者相互作用，为研发CN/NFAT通路更好的抑制剂提供新的方法和思路。