仿生矿化法提高基因Ⅶ型新城疫活疫苗热稳定性及免疫原性的研究

Newcastle disease (ND) is one of the most severe viral diseases caused by Newcastle disease virus (NDV), which poses huge economic loss to the poultry industry. The vaccination is a most effective strategy against ND. So far, the widely used ND vaccines in China are developed by the genotype II strains. However, the current vaccines did not provide full protection against genotype VII NDVs that are predominantly circulating in China. In addition, due to the low thermostability and poor immunogenicity of traditional ND vaccines the prevention and control of ND have been largely dampened currently. Therefore, our current project focuses on generation of a genotype VII ND vaccine candidate strain with an attenuated virulence and perfect growth property by utilizing the reverse genetics platform. To enhance the thermostability and potential immunogenicity of the ND candidate strain, we encapsulate the virus particle with silicon dioxide and the branched cationic polyamine polymer PGEA by biomimetic mineralization. Subsequently, the assessment of the encapsulated live strain will be conducted for its physical, chemical and biological characteristics in vitro and in vivo. Our expected achievement will meet the requirements of national program of animal disease control on ND, and the poultry industry in practice.

新城疫是由新城疫病毒引起的严重危害家禽的疫病，给家禽养殖业造成了严重的经济损失，而疫苗免疫是降低损失的最有效防控措施之一。目前，我国广泛使用的新城疫疫苗来源于基因Ⅱ型毒株，但对当前流行的基因Ⅶ型毒株不能提供理想的保护效果；同时由于传统新城疫疫苗热稳定性差、免疫原性低等问题严重制约新城疫防控效果。针对该现状，利用反向遗传技术构建一株毒力高度致弱、生长特性优良的基因Ⅶ型新城疫减毒疫苗株；通过仿生矿化技术将无机矿物二氧化硅和支链状阳离子多胺聚合物PGEA包裹在病毒表面制备矿化减毒疫苗，并评价矿化前后疫苗株的理化特性、生物学特性、热稳定性和免疫原性等，以期利用二氧化硅的热稳定性和PGEA良好的细胞结合能力提高矿化后疫苗的热稳定性和免疫原性，研发一种热稳定性好、免疫原性高的基因Ⅶ型新城疫减毒活疫苗。本研究成果可满足新城疫动物疫病防控的国家需求和家禽养殖的现地需求。

仿生矿化在提升疫苗的免疫原性方面具有广阔的应用前景。本项目通过仿生矿化法将基因VII型新城疫疫苗株病毒(MG7)包裹在聚乙烯亚胺(PEI)和二氧化硅(SiO2)里面得到矿化活疫苗MG7@SiO2-PEI，或将MG7承载于(SiO2+PEI)微粒表面得到矿化活疫苗(SiO2+PEI)@MG7，并通过体内/外实验研究矿化对活疫苗的理化特性、生物学特性及免疫原性的影响。矿化之后疫苗的zeta电位均有所升高，MG7@SiO2-PEI的zeta电位升高幅度尤为显著。qPCR检测矿化效率发现，两种矿化方法的矿化效率均在99%以上，且MG7@SiO2-PEI的矿化效率高于(SiO2+PEI)@MG7。透射电镜(TEM)和动态光散射检测结果表明，较之MG7矿化疫苗MG7@SiO2-PEI的病毒形态没有发生改变，是粒径均为200 nm-300 nm的球形或椭球形；(SiO2+PEI)@MG7则为1000-2000 nm的球形微米颗粒。能量色散X射线光谱图(EDX)显示两种矿化疫苗中均含有Si而MG7中没有Si；元素面扫描图显示只存在于病毒蛋白中的S在MG7@SiO2-PEI表面的含量明显少于MG7，(SiO2+PEI)@MG7表面的S含量则与MG7相当。间接免疫荧光实验显示矿化并没有影响病毒在BHK细胞上的复制能力。以上数据说明活疫苗的硅矿化是成功的。颈部皮下注射疫苗免疫4周龄SPF鸡，采集免疫后SPF鸡的脏器、血清、胆汁及脾脏淋巴细胞检测分析以评价矿化疫苗的免疫原性；并用强毒攻毒检测矿化疫苗免疫SPF鸡后的保护效率。相较于MG7和(SiO2+PEI)@MG7，MG7@SiO2-PEI免疫后诱导机体产生抗体的持续期最长，眼泪中IgA的含量最高，抗原特异性CD3+CD4+和CD3+CD8+ T细胞的含量最多，说明MG7@SiO2-PEI免疫能激发机体产生较MG7和(SiO2+PEI)@MG7强的黏膜免疫应答和细胞免疫应答。采集强毒攻毒免疫后的SPF鸡的肺、法氏囊、气管、脑等脏器及咽拭子和泄殖腔拭子检测病毒滴度，发现滴度均为0，疫苗免疫抑制了病毒在机体组织中的复制。矿化没有影响减毒活疫苗的保护效力。本项目为仿生矿化法提高活疫苗的免疫原性提供了数据支持和实验依据。