基于创新体外分析技术对雄黄及其制剂中砷形态与体内毒效的相关性研究

Mineral arsenicals such as Realgar(As4S4 and AsS) has been widely used in traditional Chinese medicines for thousands of years, and claimed to have therapeutic effects. Since Arsenic(As) is highly toxic subatances, its safety is concerned. However the material basis for toxicity and activity of Realgar was not very clearly by far. It is very urgent to find the material basis of Realgar and it's preparations to reveal the relationship of the efficacy and toxicity in vitro and in vivo by a reasonable and feasible analytical technique, which can guide drug quality control and clinical application..Based on the biological transformation of Realgar ingredients in vivo,the project is going to utilize bionic technology in vitro simulating the environment of human body to extract As,and with special technology to purify, use ICP-MS / HPLC-ICP-MS to study the arsenic speciations of Realgar and its preparations in the metabolism and distribution process of body. The aim of our research is to find the relationship between material basis of efficacy and toxic effects of Realgar and its preparations in vivo, and find the proportion of arsenic specition can be liberated into an absorbable form within the body and be detected by rational techniques in vitro.

雄黄是一种以含砷化合物为主的应用广泛、疗效独特的常用中药材，目前关于雄黄发挥疗效和毒性作用的物质基础尚不十分明确，迫切需要以合理的分析技术开展针对雄黄中砷体内外形态的研究揭示雄黄及其制剂在体内发挥疗效和毒性作用的物质基础，从而指导药品的质量控制和临床合理用药。.本课题根据雄黄成分进入体内的生物转化规律，运用体外仿生技术模拟体内环境，采用特殊净化手段，以ICP-MS及HPLC-ICP-MS联用分析技术对雄黄及其制剂中砷在各种代谢和分布情况下的存在形态进行全面的分析研究。从而通过以合理可行的体外分析技术阐明砷的形态与雄黄及其制剂体内疗效和毒效之间的密切关系。

前期研究证实雄黄主要成分为As4S4及少量AsS，明确主成分物质结构及炮制的主要作用。在此基础上，通过对雄黄溶解性质的研究，揭示了雄黄中溶出的砷并非来源于其氧化杂质As2O3，难溶的As4S4在溶剂中通过与H2O或O2的接触，可氧化溶解生成H3AsO3，进一步氧化H3AsO4；明确了雄黄炮制过程是除去原矿物含有的毒性较大的易溶砷氧化物（如As2O3）及有毒伴生元素（如铅、铁），同时炮制过程使雄黄颗粒更细小均匀，有利于雄黄难溶成分的溶出。.通过体外模拟实验，建立了专利的雄黄体外可溶性砷提取方法，并以专属准确的ICP-MS和HPLC-ICP-MS分别测定可溶性砷总量及其形态，通过了完整的方法学验证。多批不同来源雄黄测定结果表明，雄黄可溶性砷含量远低于总砷含量，可溶性砷形态以As3+为主，并含有少量As5+。不同来源雄黄的小鼠急性毒性研究表明，小鼠LD50值与雄黄可溶性砷及其价态砷含量呈线性负相关。.通过体内单次及多次给药，研究雄黄作用的物质基础和雄黄进入体内的砷含量与体外可溶性砷的相关性。建立了专利的分析方法，对大鼠不同脏器中砷总量及其形态进行测定。研究结果表明，雄黄给药后砷在体内分布较广，砷形态以二甲基砷（DMA）为主，证实雄黄可溶性砷进入体内发生甲基化代谢分布体内；血液中砷浓度最高，血液中总砷含量占给药雄黄可溶性砷的30%以上；血液中98%以上为DMA，高剂量时含极少量MMA；肝脏、肾脏中除DMA外，As3+、MMA、As5+含量变化显著，确证了肝脏和肾脏是可溶性砷甲基化代谢的主要器官,As3+和As5+毒性较大，可能导致肝肾损伤。雄黄中砷在体内为代谢和排出时间长，单次给药5天后，血液及各脏器中砷浓度仍为空白对照组5～12倍。多次给药后停药2个月，血液和各脏器砷含量仍为空白对照组的2～10倍，肾脏中蓄积倍数最大。.雄黄单次给药后，90%以上的As4S4由粪便排除体外，粪便排除量与给药剂量呈线性负相关；单次给药后体内吸收的砷与雄黄含有的可溶性砷比例相当，证明体外模拟提取可溶性砷与体内吸收的砷一致。雄黄多次给药后，体内砷总量和形态的变化规律与单次给药不同，但体内吸收的砷与可溶性砷具有一定相关性。阐明可雄黄可溶性砷是雄黄体内疗效和毒效的物质基础，为雄黄临床合理给药提供依据；所建立的体外可溶性分析方法与体内吸收相关性好，为科学合理评价雄黄及其制剂的毒性和疗效提供评价依据。