鸟分枝杆菌在巨噬细胞内生存机制的研究

Mycobacterium avium is intracellular parasitic bacteria with high incidence to cause spreading infections during advanced AIDS. In order to reveal the mechanisms of Mycobacterium avium-related pathogenesis, we will construct Mycobacterium avium phoP mutant strains, use real time quantitative PCR and gel mobility shift assay to investigate the transcriptional regulation by PhoP. We will also construct genomic library of Mycobacterium avium and screen reactive oxygen and reactive nitro-tolerated genes to examine the transcriptinal adaptation of Mycobacterium avium within macrophages.In addition, in order to elucidate the molecular mechanisms of apoptosis of immune cells during differential stages of mycobacterial infection, we will establish in vitro model of macrophages infected with Mycobacterium and utilize flow cytometry, ELISA and other techniques to detect apoptosis and cytokine changes in Mycobacterium-infected macrophages. Through the above studies, we anticipate to reveal how Mycobacterium avium survives within cells and the differential pathogenic mechanisms of Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis. Our study will provide new ideas for future development of target drugs for treatment of Mycobacterium avium disease and tuberculosis.

鸟分枝杆菌是细胞内寄生菌，在艾滋病晚期常可发生鸟分枝杆菌的扩散性感染。为揭示鸟分枝杆菌的致病机理，本研究拟通过构建鸟分枝杆菌phoP突变株，运用实时定量PCR、凝胶迁移实验等方法研究转录调控子PhoP转录调控的机制；通过构建鸟分枝杆菌基因组文库，筛选耐受活性氧和活性硝基的相关基因，以认识鸟分枝杆菌适应巨噬细胞的杀（抑）菌机制；通过建立体外分枝杆菌感染巨噬细胞模型，运用流式细胞仪、ELISA等技术检测巨噬细胞感染后凋亡率的变化及相关细胞因子含量的变化，以了解分枝杆菌感染的不同时期机体免疫细胞凋亡的现象以及凋亡的分子机制。通过上述研究，揭示鸟分枝杆菌在体内存活的分子机理，阐明鸟分枝杆菌与结核分枝杆菌在致病机制上的差异，为今后获得潜在的药物靶标来治疗鸟分枝杆菌病及结核病提供新的思路。

鸟分枝杆菌是非结核分枝杆菌中重要的种属之一，被其感染后可引起淋巴结炎、淋巴结核、脑膜炎等，然而其导致的肺部病变与结核分枝杆菌导致的肺结核很相似。目前非结核分枝杆菌导致的疾病越来越受到重视，但非结核分枝杆菌相关的研究很少，无法为临床提供强有力的支撑。为揭示鸟分枝杆菌的致病机理，本项目通过构建鸟分枝杆菌phoP突变株，研究调控子PhoP转录调控的机制，以认识鸟分枝杆菌胞内的生存能力；通过构建鸟分枝杆菌基因组文库，筛选耐受活性氧和活性硝基相关基因，以认识鸟分枝杆菌适应巨噬细胞的杀（抑）菌机制；通过建立体外鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型，检测巨噬细胞感染后的凋亡率的变化及相关细胞因子含量的变化，以了解分枝杆菌感染的不同时期机体免疫细胞凋亡的现象以及凋亡的分子机制；通过建立鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型，分析鸟分枝杆菌与结核分枝杆菌感染巨噬细胞引致的差异表达蛋白，以揭示鸟分枝杆菌与结核分枝杆菌的致病差异。结果发现：PhoP不仅可调控其下游基因MAV0127和Amt的转录水平，还可调控其自身基因的转录；筛选到一个耐受活性硝基和活性氧的基因noA，且含有重组noA基因的大肠杆菌能抵抗GSNO、NaNO2和 H2O2；鸟分枝杆菌在感染宿主巨噬细胞早期，可通过TLR2和TLR6调节TNF-a的产生来诱导吞噬分枝杆菌的巨噬细胞凋亡；鸟分枝杆菌感染组有明显差异而结核杆菌感染组无明显差异的蛋白共有369个，它们的功能涉及膜结合、催化活性、代谢过程、细胞组份及细胞增殖等。这些研究结果提示，分枝杆菌感染宿主引发致病是个复杂的过程，宿主为清除病原菌而调动各种防卫体系。而为了适应宿主的不利环境和抵抗宿主防卫机制，并合成一些毒力因子主动攻击宿主或对宿主具有毒性，分枝杆菌必须具备有在不同环境刺激下开启与关闭特定基因表达的能力。本项目研究鸟分枝杆菌在体内生存的机制，不仅可以揭示鸟分枝杆菌与结核分枝杆菌在致病机制上的差异，而且有望获得潜在的药物靶标，为鸟分枝杆菌病的治疗提供新的思路。