Eha调控靶基因影响迟缓爱德华菌在巨噬细胞内生存的机制研究

The infection of Edwardsiella tarda (ET) can cause a tremendous hazard in Aquaculture. It is the key point to infect hosts for the pathogen to be able to survive in macrophage, but the mechnism has not been known vell very. The claimer firstly found a ET haemolysin activator (eha)gene in ET, which encoded an important global transcriptive regulator. The results further showed that the LD50 of Δeha was 2.5 times more than that of the wild, that the cytotoxicity of the Δeha strains to cells and tissues was lower than that of the wild strains, and that the survival viability of the Δeha in macrophage and its survival rates in H2O2 and acid stress environments were lower than ones of the wild，and that the cells infected with the Δeha emerged apoptosis characteristic. Our research supported the Eha can play an important role to regulate target genes to affect ET intracellular survival of macrophage. So we will look for the genes of the expression difference between the Δeha and the wild by RNA sequencing, and will find the target genes combined with the Eha by CHIP, and will further analyses the mechanism of the target genes regulated by the Eha to affect ET intracellular survival in macrophage. These results will reveal the Eha function, and will understand the characterization of ET transcription and regulation. They will help to consummate ET regulatory network and make for controlling ET infection.

迟缓爱德华菌(ET)的感染给水产养殖业造成的危害很大，该菌在巨噬细胞的生存是其致病的关键环节,但其适应机制还不很清楚。申请者前期在ET菌中发现了一个溶血活化基因（eha），它编码一个重要的全局调控转录子，相关成果已发表SCI论文。研究发现，eha缺失株的毒力低于野生株2.5倍；该缺失株的细胞和组织毒性明显下降、在巨噬细胞内的生存能力以及在模拟H2O2和酸性环境的存活率均明显降低；而且该缺失株感染细胞后，细胞出现凋亡特征。这些结果提示，eha能够通过靶基因对ET菌在巨噬细胞内存活起重要作用。本项目拟通过RNA测序技术寻找野生株与eha缺失株间的差异表达基因，再通过CHIP技术，在细胞内环境下发现与Eha蛋白结合的靶基因，进一步分析Eha调控靶基因影响细菌在巨噬细胞内生存的机制，揭示Eha转录因子的调控功能，了解ET菌转录调控的特点,进一步完善它的转录调控网络，为控制ET菌的感染奠定基础。

迟缓爱德华菌（ ET）能够感染鱼类、哺乳动物包括人类等广泛宿主，给水产养殖业造成了很大危害。ET 菌一定具有某种独特的调控机制来适应各种宿主的环境，ET菌能够在巨噬细胞内生存，是其致病的重要环节。Eha 在ET菌系统感染中是一个重要的全局转录调控子，很可能影响细菌胞内生存和毒力。本研究通过转录组测序及染色质免疫共沉淀(ChIP)等技术，完成以下内容：首先通过体外模拟在巨噬细胞内的生存环境,检测不同酸性和氧化环境下的 eha 转录水平，我们选择一个水平最高的条件pH=6.3。在通过二代测序技术 Solexa/ Illumina 平台,研究 ET-13 野生株与 eha 缺失株转录谱的变化，对转录组结果的组装与评估后,并进一步釆用荧光定量 PCR 验证，发现两个样本中差异表达基因（DEGs）147个。基于COG数据库对147个DEGs进行功能聚类分析,分成25类；基于KEGG数据库显著性富集分析，有130个DEGs可以富集到55条代谢通路中。用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀 Eha-DNA 片段, RNA- Sequencing的设计引物，以ChIP得到的DNA样品为模板，进行qPCR，筛选出10个Eha直接结合的靶基因。通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异, 证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用。分别缺失 ET-13 野生株、 eha 缺失株、靶基因缺失株，eha-靶基因缺失株和相应的互补株。 通过比较这些菌株感染 RAW264.7 细胞内的繁殖速率, 结果表明: Eha 蛋白调控靶基因影响ET菌ET-13株细菌在巨噬细胞内生存。比较这些菌株在模拟巨噬细胞内氧化和酸性环境；流式检测比较这些菌株感染巨噬细胞后产生活性氧的水平；WST-8 和 LDH 细胞毒性比较这些菌株感染巨噬细胞的细胞毒性。因此，Eha 蛋白调控靶基因影响ET菌抗氧化和抗酸化，从而影响细菌在巨噬细胞内生存。此外，Eha 蛋白调控靶基因影响ET菌生物膜、外膜蛋白、运动和伴侣蛋白。本研究从转录组结果发现，13个具有启动子的新sRNA，其中EsR240能够调控靶基因影响ET菌ET-13株在巨噬细胞内生存，而且III 型分泌系统eseC影响ET菌CD株在巨噬细胞内生.本研究为完善ET菌转录调控网络，控制ET菌的感染提供了新思路。