含ARDHs结构域的效应子蛋白在布鲁氏菌巨噬细胞内生存中的作用机制研究

IV型分泌系统（TFSS）在促进布鲁氏菌囊泡成熟、抑制吞噬融酶体形成、建立复制生态位和抑制宿主细胞凋亡中发挥关键作用。本项目拟在前期研究TFSS调控布鲁氏菌胞内生存的基础上，以新发现的ARDHs结构域的效应子蛋白为研究对象，利用RT-PCR、cya融合等方法，分析这些蛋白在细胞内的合成与分泌和利用泛素化-蛋白酶体的分解规律；通过比较分析其突变株抑制吞噬融酶体形成、抑制凋亡等特性的变化，分析它们在布鲁氏菌巨噬细胞内生存中的作用。利用酵母双杂交、免疫共沉淀等方法，分离鉴定并验证与效应子蛋白相互作用的宿主蛋白，分析布鲁氏菌如何通过效应子蛋白作用于宿主细胞的信号通路促进布鲁氏菌在巨噬细胞内的存活。综合以上研究数据，从细菌与宿主相互作用的角度，探究布鲁氏菌如何通过效应子蛋白实现在巨噬细胞的存活和复制，进一步了解布鲁氏菌的胞内生存机制，也为布鲁氏菌疫苗和治疗药物的开发奠定基础。

本研究中，我们首先构建了布鲁氏菌T4SS缺失突变株以及8个效应子缺失的突变株，体外模拟了多个体内的条件，包括酸、氧化压力、高盐、热休克、高渗等胁迫因素，观察它们在这些条件作用下的生长能力，研究了它们在小鼠体内的生存能力以及对小鼠的毒力情况。在克隆出效应子基因后，研究了其中5个效应子在细胞内的定位情况，发现这些蛋白的胞内定位迥然不同，可能与它们的作用机制有关；研究了1275和2005与PtdIns(3,4)P的共定位情况，发现明2005有可能与胞内的PtdIns(3,4)P结合；采用酵母双杂交实验发现布鲁氏菌与人体蛋白相互作用共111对，对读框正确的74对相互作用进行了回转验证，共28对相互作用表现为阳性，回转阳性率为38.8％。最后，重点研究了BAB0279作用于宿主NF-κB信号通路的分子机制，结果发现：BAB0279突变体在体内早期感染过程中存在缺陷，这可能是由于BAB0279能特异性作用于MAL，但不是MyD88，抑制NF-κB活化。免疫共沉淀分析表明，BAB0279的C末端是结合所必须，也足够与MAL结合，而N末端则不是必要的。GFP-BAB0279的C端能够导致细胞变化，他们中的一些与RFP-GGA1共定位，并且许多看起来定位于细胞核，报告基因分析表明只有BAB0279-C而不是BAB0279-N或者BAB0279-G158A能够抑制NF-κB活化，并且这个抑制效应是剂量依赖性的。总之，本研究在分析所有的8个效应子功能的基础上，深入研究了BAB0279的功能和作用机制，对于加深我们布鲁氏菌致病机制的理解具有重要的意义。