E2F1-QKI-pRb/E2F1：一个新的E2F1负反馈机制在结肠上皮增殖与分化平衡调节中的作用

申请者前期发现结肠上皮细胞中RNA结合蛋白QKI可抑制β-catenin转录活性、增强p27表达（Gastroenterology，2010）；而我们正在进行的研究首次发现E2F1可促进QKI表达。据此我们推测：结肠上皮增殖过程中E2F1转录激活QKI，后者通过协同调节p27等靶基因反馈性抑制E2F1，形成负反馈；该负反馈环路延长细胞G1期时相，在防止细胞过度增殖的同时为细胞分化提供时间保证，是机体维持增殖分化平衡、防止肿瘤发生的重要机制。本项目拟在前期研究基础上进一步明确E2F1上调QKI的具体机制；然后改变QKI表达，观察细胞E2F1活性和G1期长短的改变，阐明QKI对E2F1的负反馈调控；最后在细胞和动物水平阻断QKI对E2F1的负反馈调控，观察结肠上皮增殖分化状态的改变以及发生腺瘤的可能性，明确QKI反馈性抑制E2F1在结肠上皮增殖分化平衡调节中的作用，为结肠癌的防治提供新思路。

本研究综合运用体外细胞培养和基因干预的体外模型、小鼠肠道上皮细胞分化的体内模型、人胃癌和结肠癌临床样本，系统观察了RNA结合蛋白QKI对胃肠道细胞增殖、分化的调控机制，及其异常与胃肠道肿瘤的关系；取得以下发现：1）发现RNA结合蛋白随着肠道发育表达动态变化，在干细胞区低表达，而在非干细胞区表达增加，表达增加的QKI抑制细胞增殖、促进细胞分化；2）QKI能够与靶分子p27、β-catenin相互作用，增加p27 mRNA的稳定性，促进其表达表达，同时又能调节β-catenin的局部翻译，抑制后者的核定位；QKI通过协同调控多个靶基因，最终调控细胞周期，延长G1期，抑制细胞增殖、促进细胞分化；3）胃癌样本中，QKI存在普遍性表达降低，表达降低的QKI与表达增高的cyclinE呈负相关；QKI表达水平和胃癌的分期分级呈负相关；表达较高水平的QKI的胃癌患者预后较好；4）RNA结合蛋白QKI能够与长链非编码RNA HOTAIR发生相互作用。而HOTAIR作为一种非编码RNA可以通过调节基因的表达，参与细胞功能调控，HOTAIR可以调节多个细胞增殖相关分子、影响细胞功能，为QKI功能及作用机制提供了新思路；目前，课题组正在构建HOTAIR的Flox小鼠，为进一步研究QKI和HOTAIR相互作用及其功能奠定基础。5）在项目实施过程中对某些实验方法进行了改建，建立了随机RNA慢病毒干涉文库的方法，为筛选功能基因提供了新的平台。