E2F1对c-Myc/hTERT信号通路的负反馈调控机制研究

c-Myc及E2F1相关信号途径是决定细胞命运的核心机制之一，研究已证实hTERT是两者共同的下游靶基因，不同的是：c-Myc诱导hTERT表达，而E2F1抑制hTERT表达。由于E2F1也受c-Myc正性调节，因此我们推测：在正常细胞中，E2F1可能对c-Myc-hTERT信号途径存在负反馈调控。miR-17-92家族是c-Myc/E2F1相对表达调控的重要因素，三者间也存在反馈调节，由此我们进一步提出：miR-17-92对c-Myc及E2F1相对表达水平的调节也可参与hTERT表达的调控。本项目拟采用基因转染、Chip、反向Chip等技术证实E2F1对c-Myc诱导hTERT表达的负反馈调控作用。进而干预miR-17-92表达，探讨其对c-Myc/E2F1及下游hTERT表达水平的影响。本项目将揭示一种新的正常细胞应对c-Myc激活的负反馈调控机制，也将加深对c-Myc致癌机理的理解。

本项目目前已基本完成。.研究结果：1）c-Myc活化对HEF细胞hTERT和E2F1表达及下游信号通路的影响。以Ad-c-Myc重组腺病毒感染HEF细胞，qRT-PCR及Western blot检测c-Myc活化对E2F1和hTERT mRNA及蛋白表达水平的影响，结果显示，c-Myc激活可以同时诱导E2F1和hTERT的表达，不同的是，仅在c-Myc高度激活时E2F1表达水平有显著提高，而hTERT表达则呈现一定的剂量依赖性。进一步，我们证实在c-Myc高度激活时，E2F1蛋白表达水平显著提高，并致细胞凋亡比率增加；在c-Myc中低度激活时，抑制E2F1表达，可致hTERT活化水平上升；而在c-Myc高度激活时抑制E2F1表达，可避免细胞进入凋亡程序，且细胞端粒酶活性有进一步增加。2）E2F1通过与hTERT启动子区域结合对c-Myc诱导hTERT表达进行负反馈调控。我们首先应用双荧光素酶报告基因证实在HEF细胞中E2F1可通过直接与hTERT启动子结合而抑制hTERT基因表达；随后应用CHIP实验（anti-E2F1）进一步验证E2F1可与hTERT启动子区域直接结合； CHIP-re-CHIP实验（anti-E2F1和anti-c-Myc）则显示c-Myc活化时同时与hTERT启动子区域结合的c-Myc及E2F1蛋白水平增加。3）miR-17-92家族对c-Myc/E2F1及下游hTERT信号通路的影响。首先应用双荧光素酶报告基因实验证实在HEF细胞中miR-17-92（miR-20a/miR-17-5p）对E2F1有直接的调控作用；进而，我们上调了c-Myc活化时HEF细胞中miR-17-92（miR-20a/miR-17-5p）的水平，结果显示其可解除E2F1对c-Myc-hTERT信号通路传导的限制，提示miR-17-92参与了c-Myc c/E2F1及下游hTERT信号通路的调控。.结论.在正常细胞中，E2F1对c-Myc诱导hTERT表达起到关键的负反馈调控作用，其对限制c-Myc-hTERT信号通路的传导具有重要意义；miR-17-92家族上调表达则可解除E2F1对c-Myc-hTERT信号通路传导的限制作用，导致肿瘤发生。