牡丹内生真菌与其丹皮道地性成因的相关性研究

In this study, we are going to isolate, identify the endophytic fungi from Paeonia suffruticosa which belong to genuine Cortex Moutan population or no genuine Cortex Moutan population; screen the endophytic fungi which have the same or the similar secondary metabolite with Cortex Moutan; determin the content of endophytic fungi quantificationally in the Paeonia suffruticosa with realtime fluores-cence quantitative PCR; study on the relationship between endophytic fungi of Paeonia suffruticosa and the genuineness of Cortex Moutan. We hope to provide new ideas for understanding the formation reasons and the formation mechanism of genuine medicinal material, and provide theoretical data to clarify the scientific connotation of Chinese herbal medicines authentic.

本研究以道地丹皮和非道地丹皮的牡丹种群为研究对象，分离鉴定牡丹内生真菌，分析内生真菌的次生代谢物、扩增内生真菌的PKS、NRPS等生物合成相关基因、筛选到能产生与丹皮具有相同或者相似活性成分的目标内生真菌；荧光定量PCR测定牡丹中该内生真菌的含量，并研究牡丹中内生真菌的感染量与其丹皮道地性的关系。以期为理解牡丹丹皮道地性的形成机理提供新思路，为阐明中药材地道性的科学内涵提供理论资料。

本研究测定了道地丹皮和非道地丹皮的丹皮酚含量，并对比其高效液相色谱指纹图谱；分离鉴定不同牡丹种群内生真菌，并分析其种群多样性；分析内生真菌次生代谢物筛选出产丹皮酚的牡丹内生真菌；检测牡丹内生真菌的聚酮合成酶（PKS ）和非核糖体多肽合成酶（NRPS）等生物合成相关基因；用荧光定量PCR 测定不同产区牡丹内产丹皮酚的内生真菌的含量。. 主要结果如下：1、丹皮酚含量测定结果显示安徽凤丹白、洛阳红、重庆太平红、山东菏泽赵粉、洛阳凤丹等5种牡丹丹皮中的丹皮酚含量依次为：24.51 mg/g，14.29 mg/g，13.99 mg/g，13.08 mg/g，8.76 mg/g。2、牡丹内生真菌分类鉴定结果显示安徽凤丹、洛阳凤丹、洛阳红三种牡丹种群的内生真菌分属于17、9、10个不同的种属，优势菌种属分别是Phomopsis（拟茎点霉属）、Fusarium（镰孢菌属）、Alternaria（链格孢属）。3、筛选出产丹皮酚的牡丹内生真菌16株，分布于9个种属，其中Fusarium（镰孢菌属）是产丹皮酚内生真菌的优势菌种。4、从三种牡丹的内生真菌群体中筛选出含有PKS和NRPS基因片段的内生真菌，并统计了PKS和NRPS基因筛选阳性率。结果显示安徽凤丹中分离的内生真菌PKS阳性率48.15%大于洛阳凤丹（41.07%）和洛阳红（44.59%），NRPS阳性率11.11%大于洛阳凤丹（7.14%）和洛阳红（1.35%）。5、从荧光定量PCR检测结果来看，产丹皮酚的镰孢属牡丹内生真菌内生真菌S3B1-3 在安徽、重庆、山东、洛阳四个地区5 个不同类型牡丹种群中的均有分布，但在重庆太平红、安徽凤丹牡丹种群中定殖量少。道地药材安徽凤丹无论是在内生真菌多样性，产丹皮酚内生真菌筛选阳性率、生物合成相关基因PKS，NRPS检出率等方面都高于非道地产区的牡丹。以上研究结果提示牡丹内生真菌与其丹皮道地性成因方面存在相关性。