髓系细胞分化相关转录因子对人巨细胞病毒UL111.A 基因选择性剪接的调控研究

人巨细胞病毒(HCMV)可在宿主细胞内潜伏感染及再激活，研究认为HCMV UL111.A 基因的选择性剪接表达现象与此特殊的感染特性密切相关；已证实髓系细胞的发育分化可使HCMV 潜伏感染向再激活转化。由此我们推测髓系细胞分化过程中差异表达的转录因子可能参与了UL111.A 基因选择性剪接的转录调控。本项目拟采用THP-1 细胞的HCMV 潜伏感染与再激活模型，通过实时荧光定量RT-PCR、染色质免疫沉淀技术、免疫印迹及RNA 干扰等手段，定量分析HCMV 潜伏感染与再激活时UL111.A 基因不同转录子的表达情况，明确参与调控UL111.A 基因转录的髓系细胞分化相关转录因子，并探讨相关转录因子对UL111.A 基因选择性剪接表达的调控。本项目将病毒基因的选择性剪接转录与宿主细胞的发育分化结合起来进行研究，为阐明HCMV 潜伏感染及再激活机制提供新思路。

本项目基本按照各年度研究计划顺利地完成，并得到了预期的研究结果。在本研究中，我们成功建立了HCMV感染THP-1细胞的潜伏与激活感染模型。研究表明UL111.A 基因具有独特的与HCMV 潜伏感染及再激活相关的选择性剪接现象，RT-PCR 检测UL111.A 基因2种转录子cmvIL-10 和LAcmvIL-10的表达水平，发现潜伏感染中只表达LAcmvIL-10，而激活感染中，cmvIL-10 和LAcmvIL-10都表达。由于HCMV的潜伏再激活与髓系细胞的发育分化密切联系，而髓系细胞的发育分化过程又与转录因子的表达和调控功能的变化相伴随，我们的目标即是证实是否正由于这些转录因子的表达和调控功能的变化导致了HCMV 潜伏感染及再激活过程中UL111.A 基因转录子的选择性剪接。对UL111.A基因5’端上游约5.0kb序列进行生物信息学分析，发现其中交错分布着许多与髓系发育相关的转录因子的结合位点，我们选取了AML-1、C/EBPβ、GATA-1、NF-κb这4个髓系转录因子进行研究。Western Blot 分析发现AML-1、GATA-1、NF-κb在HCMV潜伏感染中表达高于激活感染中；C/EBPβ在HCMV激活感染中表达高于潜伏感染。ChIP分析发现，激活感染时，AML-1、GATA-1、C/EBPβ与HCMV UL111.A基因5’上游序列的结合率高于潜伏感染时，而NF-κb未检测到与HCMV UL111.A基因启动子区有结合。HCMV潜伏感染中，AML-1、GATA-1结合区组蛋白H3-K9存在高甲基化低乙酰化的转录抑制标记；HCMV激活感染时，AML-1结合区组蛋白H3-K9存在高乙酰化低甲基化的转录活化标记。RNAi技术验证了参与上述转录调控的转录因子AML-1，AML-1 siRNA干扰转录因子AML-1的表达后， AML-1表达量下降；潜伏感染时AML-1与HCMV UL111.A基因5’上游序列的结合率显著低于未转染组；AML-1 siRNA转染组UL111.A的表达也显著低于未转染组。由此，我们初步确定了AML-1、GATA-1、C/EBPβ可参与调控HCMV UL111.A基因选择性剪接，进而参与HCMV潜伏及激活过程。.通过本研究项目发表了4篇高质量学术论文；参加了3 次国内学术交流；培养了4名硕士研究生（其中3名已毕业，1名在读）。