应用目标区域捕获结合二代测序技术定位我国非综合征型唇腭裂的致病突变

Cleft lip and palate (CLP) has notable ethnic and regional differences in prevalence over the world. China is among the regions of high prevalence of CLP, with a rate 1.2‰. Previous studies imply there must exist causal variants specific to its population. Although many genetic risk genes/loci have been identified for the disease, causal variants have not been identified in most of them. The aim of this study is to identify causative variants specific to the Chinese population. In the study target capturing chips will be designed according to reported genes and the ones from our own studies on Chinese. Target capturing and next-generation sequencing will be performed for 120 cases of nonsyndromic CLP(NSCLP) and 10 controls. Candidate variants will be identified through bioinformatical analysis and tested in 1000 cases and 1000 controls by Sequenom to identify the causative variants. Lastly, the biological functions of these variants will be investigated. Research results will help to uncover the molecular mechanism of NSCLP specific to the Chinese population, and provide foundations for disease prevention, diagnosis and genetic consulting.

在世界范围内，唇腭裂的发病率存在显著的种族和地域差异。我国是唇腭裂的高发地区，发病率高达1.2‰，前人研究提示中国人群存在特异的致病突变。目前已报道了该病的多个遗传风险基因和区域，但多数并未找到明确的功能性致病突变。本研究力求定位我国非综合征型唇腭裂的特异性致病突变。我们拟选择三种亚型的非综合征型唇腭裂患者120例和正常对照10例，对已报道的唇腭裂风险基因和本研究组获得的中国人群唇腭裂风险基因设计捕获芯片，进行目标区域捕获和二代测序，采用生物信息学手段对海量数据进行分析以获取候选致病突变。然后采用Sequenom方法将候选致病突变位点在1000例唇腭裂患者和1000例正常对照中进行大样本量验证，最终找到主要致病位点，并对其进行细胞生物学功能研究。本研究将揭示我国非综合征型唇腭裂的分子发病机制，为疾病的预防、诊断及遗传咨询提供遗传学基础。

本研究完成了34个非综合征型唇腭裂家系的全基因组外显子测序，筛选获得C5orf42、TFAP2A、AXIN2、PTPRD、IRF6、ABCA4、ROR2等候选基因，重点基因做了蛋白结构预测，为进一步开展功能实验及分子机制实验提供理论依据，为建立中国人群非综合征型唇腭裂候选致病基因数据库提供参考。.第一阶段，从中国医学科学院整形外科医院唇腭裂中心收集到散发非综合征型唇腭裂患1521例，核心家系122个（患者和父母），唇腭裂家系34个（共96个血样）。第二阶段完成了样本DNA提取及检测。选择34个非综合征型唇腭裂家系，共计96个样本进行全基因组外显子测序，测序试剂盒采用安捷伦公司的SureSelectXT Human All Exon V6+UTR全外显子捕获试剂盒，捕获区域共计90M。获取原始下机数据，并完成了数据质量检测，检测结果合格。第三阶段进行候选致病基因筛选及数据分析。最终找到C5orf42、TFAP2A、AXIN2、PTPRD等候选致病基因，并发现IRF6、ABCA4、ROR2、CARD10等已知基因未曾报道过的变异位点。重要结果分析如下：（1）候选基因C5orf42在6个家系中找到变异位点，其中两个家系突变位点一致，蛋白结构预测发现突变前后该蛋白的结构发生明显变化，磷酸化位点消失。C5orf42位于5号染色体,变异位点为错义突变（C5orf42c.3548G>A），保守性好。C5orf42与Orofaciodigital SyndromeⅥ 和Joubert Syndrome有关；C5orf42突变的小鼠模型表现为综合征型唇腭裂。C5orf42与初级纤毛的功能相关，纤毛疾病包括了唇裂表型。（2）候选基因TFAP2A 基因定位于 6 号染色体,变异位点 (6:10406995, C>T)位于转录因子结合区,该位点保守性好。TFAP2A基因编码的转录因子AP-2α，动物实验发现 AP-2α在颅面部发育中至关重要，TFAP2A 基因缺陷可引起Branchio-oculo-facial 综合征，包括唇腭裂表型。（3）候选基因AXIN2 定位于 17 号染色体，变异位点为错义突变 (c.2018G>A, p.S673F)，该位点保守性好。AXIN2 基因调节 Wnt 信号通路, 曾报道与唇腭裂相关。（4）候选基因PTPRD（chr9:8404560）编码酪氨酸磷酸酶