目标区域捕获测序探查与半侧颜面短小显著关联的染色体区域内的致病突变

Craniofacial microsomia (CFM), a severe congenital anomaly, seriously affects the physical and mental status of the patients. Our team carried out the first genome-wide association study on craniofacial microsomia in Chinese and identified 8 significantly (P < 1E-8) and 5 suggestively (1E-8 ≤ P < 1E-5) associated loci. Based on gene pathway enrichment analysis, we found lots of CFM candidate genes involved in the neural crest cell (NCC) development. It’s well known that NCCs play a paramount role in the development of the first and second branchial arches, which give rise to craniofacial structures. This finding indicates the involvement of “NCC disturbance” in the etiology of CFM. To identify the causal mutations in Chinese CFM, the 13 CFM-associated loci in 40 patients will be fine-mapped using target-capture sequencing. According to the variants calling, annotation, and filtering, the potential causal variants of CFM will be discovered; and then these candidates will be replicated in a large sample cohort using genotyping method. We will perform real-time PCR to identify causal variants that within regulatory motif of gene in cell lines of 19 CFM patients and 16 health controls. The new findings will uncover the genetic risk factors of craniofacial microsomia in Chinese, as well as provide genetic fundamental for diagnosis, therapy, and prevention of CFM.

半侧颜面短小畸形是严重危害患者身心健康的先天性遗传病，目前仍无明确的致病突变报道。本项目组前期对半侧颜面短小畸形开展了首个全基因组关联研究后找到了8个显著 (P < 1E-8) 关联和5个提示关联（1E-8 ≤ P < 1E-5）的染色体区域。这些区域内富集了和神经嵴细胞发育相关的基因，从而支持了半侧颜面短小畸形的“神经嵴细胞扰乱”假说。为了最终找到显著关联区域内的致病突变，本研究拟首先采用目标区域捕获测序策略完成半侧颜面短小畸形关联区域内关键序列的捕获和测序工作，通过生物信息学方法注释和筛查致病突变位点，然后采用基因分型的方法对候选致病位点在大样本中进行验证，并使用荧光定量PCR的方法探查调控区变异位点造成的基因表达异常，以确定我国半侧颜面短小畸形的致病突变位点。该项目结果不仅可以揭示出半侧颜面短小畸形的遗传病因，还可为该病的预防、诊断和治疗提供遗传基础。

半侧颜面短小畸形是仅次于唇腭裂的第二大颅面部先天性出生缺陷疾病，主要表现为患侧面部短小，病变可涉及颅面骨骼、肌肉、软组织、面神经及外耳等多种组织。半侧颜面短小畸形由于其畸形严重、致残率高，严重损害了患者的身心健康。以往针对半侧颜面短小畸形的研究多集中在手术技术革新和流行病学调查，而对导致疾病发生的遗传因素研究甚微。本项目组前期对半侧颜面短小畸形开展了首个全基因组关联研究，找到了8个显著关联(P < 1E-8)的染色体区域，近期的研究再次发现了7个显著关联的候选区域，但这些研究无法明确关联位点内的确切致病因素。本研究针对上述15个候选区域，采用全基因组重测序以及目标区域捕获测序相结合的策略深入挖掘半侧颜面短小畸形的致病突变。一共完成了40例半侧颜面短小畸形的全基因组重测序工作，通过相应的生物信息学分析发现了4个风险致病位点。功能分析发现这四个风险基因（SHROOM3、KLF12、PLCD3、GATA3）与神经嵴细胞的发育与迁徙相关。另外，考虑到40例样本对结果的支撑有限，我们重启了目标区域捕获研究，又完成了69例的目标区域捕获测序。通过对69例样本的目标区域捕获测序，我们发现了2个突变位点可以显著改变增强子的活性，并通过LUC系统对其进行了验证。最后，我们根据本研究的实验成果，结合课题组前期的研究结果，运用多基因风险值（PRS）评估的方法，构建了半侧颜面短小畸形的风险预测模型，可作为产前咨询的参考。总之，4个风险基因、2个增强子突变的发掘以及风险预测模型的构建，可以进一步揭示半侧颜面短小畸形的遗传病因，为NIDT技术检测孕期患病风险提供遗传学支撑。