高度模拟人类烟雾病和烟雾综合征血管和遗传特征并稳定遗传的斑马鱼和小鼠模型的构建、鉴定、比较和标化

Our previous studies have verified that frameshift mutation knockout from exon 2 of rnf213 gene resultes in loss of its function, and that such mutant zebrafish model highly mimics human moyamoya disease(MMD) and is hereditarily stable. Generation F1 is now available. The vasculature abnormality in rnf213-mutant zebrafish with knockout of ring-finger domain and AAA+ ATPase domain of rnf213 gene is less prominent than that with knockout from exon 2, indicating better suitability of rnf213-mutant MMD zebrafish model with loss of function. Nevertheless, both abroad and domestic attempts to induce mice MMD models by knocking out functional domains of rnf213 had failed. Based on current works, it is attempted to fully knockout target genes of monogenic Moyamoya Syndrome (MMS), namely gene NF1, ACTA2, BRCC3 and GUY1A3, and major susceptibility gene RNF213 of MMD by means of CRISPR/Cas9, to establish gene-modified zebrafish and mice models respectively. INF(interferon) and/or chronic ischemia by mechanic occlusion of terminal internal carotid arteries using silver clips will be plus. Then it is to be compare the vascular phenotype (stenosis/occlusion and moyamoya vessels), histopathologic characteristics under both light and electron microscopes, and respective genetic features (genotype verified by sequencing knockout genes) of both models. Finally, through hybridization with wild-type zebrafish or mice, it is aim to generate genetically stable F1 that highly simulate human MMD/MMS.

我们的前期研究证实，敲除rnf213基因2号外显子致移码突变使该基因完整敲除，成功构建了与人类烟雾病高度相似的、能稳定遗传的斑马鱼模型，目前已获得F1代。比较敲减rnf213基因的环指和ATP酶功能区的斑马鱼，其异常血管较敲除2号外显子的轻，说明完整敲除更能模拟人类MMD。而国内外单纯敲除Rnf213重要功能区构建MMD的小鼠模型均未成功。在现有工作基础上，拟用CRISPR/Cas9对单基因遗传MMS的靶基因NF1、ACTA2、BRCC3、GUCY1A3以及MMD的主要易感基因RNF213进行完整敲除，并分别构建基因修饰性的斑马鱼和小鼠模型，叠加干扰素和/或颈动脉末端银夹致慢性缺血后，对两种模型的血管表型（血管狭窄/闭塞、增生）、病理（组织病理和电镜）及其相应的遗传特征（敲除基因测序）进行鉴定和比较，通过与野生型的斑马鱼或小鼠回交后，获得能稳定遗传的F1代，高度模拟人类MMD/MMS的模型

烟雾病（Moyamoya Disease， MMD）是一种少见的脑血管疾病，主要以颈内动脉末端进行性狭窄及颅底异常的血管网为特点，其中具有MMD部分特征血管病变（有血管狭窄/闭塞，伴或不伴异常血管网形成），但伴有已知的关联疾病（如镰状细胞病，唐氏综合征），称为烟雾综合征（Moyamoya syndrome，MMS）。近年来发现数个基因与MMD/MMS密切相关，包括RNF213、GUCY1A3、BRCC3等。其中RNF213与多种脑血管疾病相关，包括颅内大动脉狭窄及颅内动脉夹层等；另外人类散发性脑海绵状血管瘤（CCM）的致病基因还未明确，我们一项对散发性CCM病人转录组测序的研究表明，RNF213是CCM的候选基因。本课题组针对以上背景通过TALEN、Crispr/Cas9构建了RNF213、BRCC3、GUCY1A3突变斑马鱼及小鼠，并进行了表型观察及下游机制分析。结果表明：（1）对人散发性脑海绵状血管瘤及健康对照病人进行测序，发现了6个有害的RNF213突变，其中3个突变可导致蛋白质翻译提前终止，观察rnf213a纯合突变体斑马鱼发现起源于后脑静脉的桑葚样血管团，芽生的血管存在循环障碍，同时肠下血管存在紊乱芽生，进一步转录组测序表明anxa6及kbtbd7基因下调，对该基因的mRNA合成拯救可恢复部分表型，表明anxa6及kbtbd7是rnf213介导桑葚样血管团形成的下游分子。（2）在brcc3-/-斑马鱼的血管表型观察发现，在斑马鱼的中上层脑血管，发现在96hpf-120hpf期间一些异常的芽生血管在后脑静脉与原始后脑交通交界处开始发出，逐渐连接至基底动脉，类似烟雾状血管，对斑马鱼进行转录组测序分析发现存在人类烟雾病血清标志物MMP9基因的表达升高，进一步QPCR验证证实了该基因表达升高。（3）在gucy1a3-/-斑马鱼突变体观察到了管腔狭窄，血流减少。在GUCY1A3-/-突变体小鼠中发现大脑中动脉内弹力膜的迂曲、不规整，HE染色表现为血管壁的增厚。（4）为了探讨抗血小板治疗对比保守治疗及手术治疗在烟雾病治疗中的有效性，我们进行了多中心回顾性临床研究，结论表明抗血小板药物在预防成人缺血性烟雾病患者进一步脑缺血发作方面是有效和安全的。对于手术禁忌症患者和血管重建术前的患者，它们可能是一种替代疗法。