以RNF213基因创始者突变p.R4810K为TALENs核心靶点构建的新Moyamoya病斑马鱼遗传模型

Our previous studies have showed that knocked out permanently exon 1 of rnf213 in Tg(flk-egfp) transfected zebrafish with transcription activator-like effector nucleases (TALENs) caused irregular wall stenosis in intracranial trunk arteries and abnormal intracranial or extracranial sprouting vessels formation, which is consistent with Moyamoya disease(MMD) in pathology. Further meta-analysis and fundamental research confirmed that p.R4810K mutation as the founder mutation in MMD greatly influenced RNF213. Moreover, p.R4810K in zebrafish was remarkably similar to humans by comparing conservative homologous sequences of RNF213.On this basis, p.R4810K was confirmed as the core target site. Knocking out the the 1, 20, 32 exons of rnf213 individually and knocking in p.R4810K and p.D4013N by TALENs to explore the pathogenic mechanisms of these mutations in vivo though protein chip and ubiquitination analysis, and observe the vessel phenotypes with two-photon microscopy, calculate the pathological changes by immunohistochemical staining/optical microscope/electron microscope, and detect the genotypic changes in order to screen the best reproduceable and transmissible stably zebrafish genetic models highly imitating human MMD.

我们的前期实验发现，利用TALENs永久敲除Tg（flk-egfp）斑马鱼rnf213基因的1号外显子致移码突变后，导致颅内主干动脉血管壁不规则狭窄、颅内外异常芽生血管形成，与Moyamoya病（MMD）病理形态一致。进一步的Meta研究和生物信息学分析表明，p.R4810K突变严重影响RNF213基因的功能，是MMD创始者突变。在比较人类和斑马鱼的RNF213基因的同源保守序列后发现，两者的p.R4810K位点序列具有高度的相似性。在此基础上，利用TALENs技术，以p.R4810K为核心靶点，通过分别敲除rnf213基因第1、20、32外显子、敲入p.4810K及p.D4013N后构建相应的斑马鱼品系，蛋白芯片及泛素化分析探索变异位点体内致病机制，并通过双光子显微镜观察斑马鱼活体的血管表型，根据光镜和电镜病理、免疫组化、基因型改变优选出高度模拟人类MMD并能稳定传代的斑马鱼遗传模型。

烟雾病（Moyamoya Disease， MMD）是一种少见的脑血管病，是儿童脑卒中的主要病因之一，主要以颈内动脉末端进行性狭窄及颅底异常的血管网为特点；近些年研究发现基因与MMD密切相关，尤其是RNF213基因。本课题组对RNF213基因多态性与MMD相关性进行了meta分析，通过TALEN及CRISPR/Cas9 技术完整敲除斑马鱼rnf213基因及相应功能区，观察了是否存在相应的类似人MMD表型，并对下游分子进行了研究。结果发现：（1）人类RNF213基因多态性与MMD的相关性Meta分析发现p.R4810K与MMD相关，相对于中国人，这种相关性在日本人及韩国人更明显；p.A4399T与亚洲MMD病人无关，p.A5021V只与中国汉族MMD患者相关。（2）利用CRISPR/Cas9及TALEN技术敲除构建rnf213a基因的斑马鱼突变体，利用TALEN技术完整敲除了斑马鱼rnf213a基因，并能稳定至成鱼；利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了rnf213a两个重要功能区（AAA+ATPases domain及RING finger domain），并能稳定至成鱼。 （3）斑马鱼rnf213a基因完整敲除突变体（F0代嵌合体）表型分析：与野生型比较，rnf213a完整敲除斑马鱼出现心脏扩大、卵黄水肿、节间血管及脑血管异常芽生、管腔狭窄、血流速度减慢，但脑血管壁结构完整。（4）斑马鱼rnf213a基因完整敲除突变体与敲除关键功能区突变体的表型比较： rnf213a基因突变斑马鱼躯干节间血管、脑血管异常程度均高于AAA+ATPases domain突变斑马鱼及RING finger domain突变斑马鱼。（5）斑马鱼rnf213a完整敲除（纯合子）表型分析：发现仍有脑血管的高度芽生，但躯干节间血管并未出现F0代嵌合体类似的表型。（6）斑马鱼rnf213a完整敲除（纯合子）进行高通量测序筛选下游分子并Qpcr验证：高通量转录组测序筛出95个有表达差异的下游分子，挑选出斑马鱼与人都共有的6个分子，进行Qpcr验证，突变体相对野生型kbtbd7、gstt2、anxa6、nudt13均是下调；nub1升高；mal无改变。（7）高尿酸与缺血性卒中预后的相关性临床研究：发现尿酸> 237 mmol/L对于男性大动脉粥样硬化性脑梗死是个保护因子。