脂肪酶选择性催化结构脂质的分子识别机制及其功能调控

Structured lipids (SLs) play an irreplaceable role in improving the balance of body fat metabolism. Enzymatic synthesis of SLs is the main direction for sustainable and healthy development of China's functional oil industry. During the reaction, the intrinsic mechanism of the region-selectivity and fatty acid specificity of lipase is the molecular recognition and affinity between enzyme and ligands. And this kind of molecular recognition and affinity contributes to the structure and biological functions of SLs. Structure-based understanding the molecular mechanism of selective recognition and interaction between lipase and ligands and even function regulation of the enzyme would be the key issues for building the general catalytic system of lipase on SLs. In this project, through solving the enzyme/triglyceride analogue complex crystal structure, analysis of molecular recognition characteristics of the reactive and non-reactive transient tetrahedral intermediate, resolving key influencing factors for the rational design of key amino acid mutations, verifying the functionality of key residues, combined with computational biology to study the effect of microenvironment disturbance on protein structure and recognition, the model of molecular recognition of sn-1,3 regio-selectivity and fatty acid specificity of lipase would be established and the mechanism would be illustrated. Furthermore, the properties of the lipase would be improved by rational design and semi-rational design of the key residues for better industrial application. This project will provide a theoretical basis for the regulation of biosynthesis of SLs and efficient development of new functional oil resources, and promote the sustainable development of China's functional oil industry.

结构脂质(SLs)在改善人体脂肪代谢平衡方面具有重要作用，其酶法改性制备是我国食用油产业健康发展的主攻方向。脂肪酶催化SLs反应中的位置选择性、脂肪酸特异性等选择性问题，在分子层面上可以归结到分子间的相互识别和亲和，这种识别和亲和的行为特征直接决定了SLs产物的结构和生理功能。如何基于结构认知探究脂肪酶与脂类配体分子间的选择性识别和作用机制，并实现酶的功能强化，是SLs酶法催化反应的关键科学问题。本课题拟通过解析酶/酯类配体晶体结构，分析比对脂肪酶“开盖”前后结构差异，研究四面体过渡态分子识别位点与键合模式，结合计算生物学与光谱学研究微环境对蛋白结构与识别特征的扰动，建立分子识别模型，阐明脂肪酶sn-1,3位置选择性与脂肪酸特异性分子识别机制；锁定关键氨基酸位点，设计理性与半理性的改造策略强化脂肪酶的催化性能，探究SLs催化反应规律，为SLs催化反应调控以及开发新功能型SLs奠定理论基础。

高脂肪膳食与多种疾病及癌症发病率上升有着密切的关系。研究表明，作为天然脂肪的替代物，结构脂质(SLs)不仅能提供丰富的营养，而且具有降低血脂、改善免疫系统等生理功能。脂肪酶的sn-1,3位置选择性及脂肪酸特异性决定了催化产物中脂肪酸的位置分布与类型， 是SLs催化制备的关键因素。然而，脂肪酶的sn-1,3位置选择性及脂肪酸特异性分子识别机制尚不明晰，因此对脂肪酶催化反应难以理性调控，导致其在实际应用过程中具有盲目性。本课题围绕SLs酶法催化反应的关键科学问题，解析了sn-1,3位置选择性脂肪酶的晶体结构以及在溶液中的NMR动态结构，鉴于脂肪酶在溶液中的结构变化和动力学是其位置特异性及界面激活的关键，通过15N NMR驰豫实验、欧沃豪斯效应图谱信号峰以及残留偶极耦合实验测定了脂肪酶在溶液中的结构及分子运动情况，阐明了sn-1,3位置选择性脂肪酶前导肽对脂肪酶性质影响机理及脂肪酶盖子在溶液中的动力学行为；基于解析的催化反应机制，确定了sn-1,3位置选择性和脂肪酸特异性的关键位点，通过突变实验改造底物结合口袋，改变了配体与酶的相互作用，从而显著提高了比酶活、sn-1,3-位置选择性和脂肪酸特异性；探索了结构脂质催化反应的溶剂环境对脂肪酶的激活机制，表明有机溶剂增大了盖子打开幅度，从而促进催化反应的进行；构建了介孔氧化硅MCFs 修饰的固定化脂肪酶体系，并利用生物大分子作为交联剂，提高了固定化脂肪酶的非水相催化活性、热稳定性、有机溶剂耐受性；利用MCFs固定化脂肪酶合成了结构脂质人乳脂替代品，并对催化反应条件进行了优化，脂肪酶高1,3-位置选择性显著提高了人乳脂替代品中1,3-二油酸-2-棕榈酸三甘酯(OPO)的含量。研究成果不仅在理论上对于酶的构效关系与催化机制研究具有重要意义，而且对于相关结构脂质产品的酶法生产也具有极大的应用价值，为推动“绿色”油脂工业的发展奠定坚实的基础。