盖子结构调控高温脂肪酶催化特性机制研究

Lid domain plays an important role on the catalytic efficiency of lipase. In this study, the lid domain of T1 lipase from Geobacillus sp. was chosen to investigate its function on catalytic property. Mutagenesis in lid domain of T1 lipase was performed by using ALA-scan, saturation mutation and lid-grafting method. The characterization of the catalytic profiles of T1 lipase mutants was carried out by cell free expression combination with micro-plate screening method. Analysis of the mutants by docking and molecular dynamics was conducted to give a deeper view of structure–function relationship of T1 lipase. The result of this study may provide a molecular basis for construction of T1 mutant with desired properties for industrial application.

脂肪酶的盖子结构是影响酶催化效率的关键因素之一。本研究以Geobacillus sp.来源的高温脂肪酶T1为研究对象，围绕其盖子区域结构对酶催化活性调控的关键问题，采用丙氨酸扫描、定点饱和突变及基因片段替换等基因工程技术构建高温脂肪酶盖子区域突变体，并利用无细胞表达偶联微板活性检测技术筛选，获得影响高温酶催化特性的关键位点。并结合分子对接及分子动力学模拟等结构生物学方法分析，探讨酶催化特性差异与盖子区关键活性氨基酸位点的关联性。本研究顺利开展可以阐明盖子结构参与调控高温脂肪酶催化特性的机制，同时也为高温脂肪酶分子的理性设计和工程化应用提供理论指导。

脂肪酶的盖子结构是影响酶催化效率的关键因素之一。本研究以Geobacillus sp.来源的高温脂肪酶T1为研究对象，围绕其盖子区域结构对酶催化活性调控的关键问题，采用结构生物学方法及蛋白质工程技术进行研究，旨在阐明盖子结构参与调控高温脂肪酶催化特性的机制。研究内容包括：（1）T1脂肪酶的高效表达、纯化及晶体的制备研究。建立了以纤维素结合蛋白作为纯化标签的高效T1脂肪酶纯化策略，同时优化了T1脂肪酶的蛋白晶体条件。（2）T1脂肪酶酶学性质研究。表征了T1脂肪酶的酶学参数，同时研究了不同类型的去垢剂对T1脂肪酶的催化活力的影响。结果表明，在低浓度的去垢剂对脂肪酶T1具有激活作用，推测可能促进盖子打开相关（3）T1脂肪酶盖子区关键氨基酸调控脂肪酶活力研究。结果表明，突变盖子区的氨基酸可提升T1脂肪酶的亲和力和催化效率，但同时会T1脂肪酶的热稳定性。（4）盖子区替换对T1脂肪酶活性的影响。构建并纯化获得了替换了来源于猪葡萄球菌的脂肪酶盖子区的T1脂肪酶嵌合体，酶学性质表明，相对于T1野生型脂肪酶，T1脂肪酶嵌合体更偏好于短链酯底物，催化反应温度明显降低变为30oC，且催化效率明显降低。（5）无盖子脂肪酶的催化特性研究。在大肠杆菌中表达了枯草芽孢杆菌(PDB:1I6W, BsLip)、落叶链霉菌 (PDB:1JFR, SeLip)、假单胞菌(PDB:2FX5, PmLip)三种微生物来源的无盖子脂肪酶，并纯化了重组酶蛋白。酶学表征研究发现，三种重组酶均能水解甘油三酯底物，但底物链长偏好各异。同时发现PmLip具有良好有机溶剂耐受能力，在50%浓度下有机溶剂处理1h，仍保持原有的催化活力，显示该酶具有潜在工业应用价值。本项目的顺利开展，推动了酶工程领域的基础学科研究，为指导脂肪酶的分子改造提供了研究基础。至今共发表论文13篇，培养硕士研究生3人。