基于砖红色丹参突变株的丹参酮类化合物生物合成功能基因的挖掘

Tanshinone is one of the main active components of Salvia miltiorrhiza on promoting blood circulation and removing blood stasis, though the research of its biosynthetic has made great progress, and its upstream biosynthesis pathway is basically clear, the unclear downstream synthesis pathway is still needed to be found out. The project will use comparative metabonomics to systematically analyze the metabolite of the mutation and normal salvia miltiorrhiza, in order to find the differences, and to identify the differences in composition related to the Tanshinone biosynthesis; To construct the DGE library of mutation and normal plant, and to get the differentially expressed candidate genes on the basis of DGE library and analysis of the temporal and spatial expression; To express the protein of the screening gens by using the prokaryotic expression and eukaryotic expression, and to carry out the enzymatic reaction by using different components as the substrate, finally to get the functional gene related to the Tanshinone biosynthesis.The result will provide the basis to the metabolic engineering, and give the theoretical foundation for the comprehensive understanding of plant metabolic network, reasonable positioning secondary metabolism and its key enzymes, and promoting the sustainable utilization of wild plant resources.

丹参酮类成分为丹参起活血化瘀作用的主要活性成分之一，其生物合成途径研究虽已取得较大进展，其上游合成途径基本清楚，但仍然存在下游合成途径不清的问题，亟待解决。本项目将利用比较代谢组学方法对突变株与正常株丹参的代谢产物进行系统的分析，找到差异，对这些与丹参酮生物合成相关的差异成分进行结构鉴定；构建突变株与正常株的DGE文库，根据DGE文库和时空表达分析，得到候选的差异表达基因；利用原核或真核表达对筛选出基因进行蛋白表达，以差异成分为底物进行酶促反应，最终获得与丹参酮生物合成相关的功能基因。项目研究成果将为代谢工程提供基础，为全面认识植物代谢网络、合理定位次生代谢及其关键酶、促进野生植物资源可持续利用提供理论依据。

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根和根茎。丹参为常用大宗药材，用药历史悠久，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效，是治疗心脑血管系统疾病的重要药物。其主要的药效物质为丹酚酸及丹参酮两大类成分，而丹参酮类化合物主要富集在根皮中，该类成分为二萜萘醌类结构，大多呈红色，因此丹参从外观性状上表现为红色，同时也呈现出颜色-成分-含量之间的关联。然而近年来在丹参产地发现有根皮呈砖红色的丹参突变株，其所含主要成分丹参酮类成分如隐丹参酮、丹参酮ⅡA等的含量显著低于正常丹参。通过代谢组学与转录组学相结合，研究正常丹参与砖红色丹参的化学成分差异，将差异成分与差异表达基进行关联分析，为筛选出与丹参酮生物合成相关的候选基因提供依据。方法：采用超高效液相色谱—飞行时间质谱法(UPLC/Q-TOF-MS)，荧光定量PCR等分析方法，开展代谢组学与转录组学分析。结果：从砖红色与正常丹参中一共鉴定出85个化合物。与正常丹参相比，丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的峰在砖红色丹参中没有，而隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ和呋喃环上呈饱和键的峰均无显著性差异。与砖红色丹参相比，73个基因显著上调，39个基因表达下调。结论：73个上调基因可能参与不同的生物学过程。其中，3个基因在根部的表达量较多，说明其在根系中的表达较丰富。为可能为参与隐丹参酮经脱氢合成丹参酮IIA的相关基因。