丹参ERF类转录因子调控丹参酮生物合成的分子机制

ERF family transcription factor (TF) represented ethylene-responsive protein which harbored a conserved AP2 domain, which palys important role plant stress response and metabolism regulation. We have successfully obtained two ERF transcription factors from Salvia miltiorrhiza supported by National Science Fund (30900110) in previous studies, designed as SmO3-L1and SmO3-L2. In present study we focus on functions of the two genes in the pathway of tanshinones synthesis, and find the right ERF transcription factors which could effectively regulate the metabolic balance of tanshinons. We will introduce the target genes into Danshen plants, and the transgenic plant lines would be used for the quantitive PCR analysis of the target genes and the genes encoding the key enzymes. The results would be help to clarify the regulation functions of ERF transcription factors for the key enzymes in the pathway. To explore the relationships between ERF transcription factors and tanshinone production, extracts of transgenic plant lines would be detected by HPLC. Moreover we will screen downstream target genes under the control of ERF transcription factors to find the molecular mechanisms of tanshinion synthsis, which will lay a basis to improve the content of tanshiniones.

ERF（ethyelne-responsive factors）是植物中特有的一类转录因子, 广泛参与植物的胁迫应答及代谢调控。申请者在前一个国家自然科学基金项目(30900110）资助下，克隆获得两个参与丹参酮代谢的ERF转录因子SmO3-L1和SmO3-L2的全长基因。本研究将深入探讨这两个转录因子对丹参酮生物合成的调控机制。采用定量PCR技术等分析其时空表达模式；通过正义过表达和RNAi基因敲除实验，明确候选基因对丹参酮合成关键酶基因（如HMGR，DXS，GGPPS和CPS等）的转录表达水平和丹参酮成分积累的影响，解析ERF转录因子对丹参酮生物合成的调控作用；用酵母双杂交结合免疫共沉淀筛选ERF的互作蛋白，以阐明ERF类转录因子在丹参酮合成调控中的分子机制，为利用代谢工程手段提高丹参中丹参酮的含量提供理论依据。

丹参是临床治疗心、脑血管疾病的常用传统中药，有效成分主要为丹参酮和丹酚酸两大类，但其生物合成关键靶点及代谢调控机制不清。植物ERF转录因子被认为在次生代谢中有重要调控作用。.本项目在前期基础上深入开展丹参酮生物合成代谢调控研究，比较了SmDXS1和SmDXS2对丹参酮积累的贡献；发现共调控MVA与MEP途径可有效促进丹参酮积累；证明了MJ促进丹参酮合成经由JAZ蛋白介导。从丹参中克隆出5条丹参ERF转录因子即SmO3L1（SmERF2），SmO3L2（SmERF5），SmO3L3，SmERF1和SmERF13，并进行了特性分析。组织表达谱分析表明均为组成型表达，但在不同组织表达各异。诱导表达谱分析表明除SmERF1外，SmO3L1, SmO3L2, SmO3L3和SmERF13均明显受MJ诱导响应。SmO3L2, SmO3L3, SmERF13不受YE诱导响应；而SmO3L1和SmERF1则受YE诱导。亚细胞分析表明上述转录因子均定位于细胞核。.对SmO3L1，SmO3L2，SmO3L3及SmERF1进行了转基因功能研究。发现SmO3L3在丹参毛状根中具有非常重要的作用，它分别参与丹参中两条重要代谢途径的调控。过表达和干扰表达研究都显示SmO3L3负调控丹参酮的合成，但正调控丹酚酸代谢合成。通过酵母单杂及EMSA等也确认了SmO3L3在这两条途径中调控的下游靶基因分别是丹参酮途径中的DXR和丹酚酸途径中的4CL1。SmO3L1和SmERF1在丹参酮合成中具有一定正调控作用，而对丹酚酸合成的影响微弱。SmO3L2对丹参酮和丹酚酸的积累影响不大，但是造成了丹参毛状根的发育迟缓。在丹参中异源表达长春花CrOCA2 和CrOCA3，结果显示CrOCA3对丹参酮和丹酚酸合成都具有一定促进作用。而CrOCA2则对丹参中次生代谢物合成没有明显影响。以上结果表明了不同ERF因子对丹参酮代谢合成的调控方式和效果存在差异。.综上，我们推测SmO3L3在丹参酮和丹酚酸合成调控中可能是主效因子，它很可能是作为丹参酮和丹酚酸合成途径的调节纽带，实现对不同代谢流之间的协同调控。而其它ERFs转录因子可能作为协同因子，参与丹参酮、丹酚酸或其它代谢的调控。本项目的实施，阐释了不同ERF因子调控丹参酮生物合成的分子机理，为深入解析有效成分形成机制及丹参品质改良提供了功能基因与重要参考依据。