丹参酮生物合成关键酶短链脱氢酶编码基因的克隆和功能鉴定

The study in elucidating tanshinone biosynthesis mainly focus on the function of CYP450 oxidase. The short-chain dehydrogenases (SDRs) catalyze hydroxyl into ketone in the biosynthesis of noscapine from Papaver somniferum and momilactone A from Oryza sativa. Here, this program supposes that SDRs are involved in tanshinone biosynthesis. The applicant has finished the construction of full-length transcriptome database in Salvia miltiorrhiza, and 5 SDR genes were selected to be related to tanshinone biosynthesis. Then, the knock down of SDR460A-TS1 expression resulted in the significant decrease of miltirone, tanshinone I, tanshinone IIA, etc. Therefore, this program will uncover the mechanism of SDRs in tanshinone pathway in vivo via cloning the candidate SDRs, constructing the transgenetic system of SDRs RNAi and overexpression, analyzing the variation of tanshinones in transgenetic lines. Furthermore, this program will verify SDRs function in tanshinone biosynthesis by codon optimization, yeast expression and enzymatic reaction in vitro. This program will help to elucidate the biosynthetic pathway of tanshinones, and pave the basic for the biosynthesis of secondary metabolites in plant kingdom.

丹参酮能有效治疗心脑血管疾病，其生源途径解析主要关注CYP450氧化酶。短链脱氢酶SDRs在罂粟诺斯卡品、水稻植保素的合成中催化羟基生成酮基，本项目提出SDRs催化丹参酮合成的学术假设。申请者已建立丹参全长转录组数据库，预测5个SDRs基因是丹参酮生物合成的关键基因，其中抑制SDR460A-TS1基因的表达导致丹参新酮、丹参酮I、丹参酮IIA等含量显著降低。据此，本项目通过对候选SDRs基因的克隆及结构分析，建立SDRs基因的RNAi和过表达转基因毛状根体系，利用代谢组技术研究转基因株系代谢物图谱变化规律，在体内揭示SDRs催化丹参酮生物合成的作用机制；进一步通过密码子优化、酵母表达、体外酶促等技术鉴定SDRs的催化底物、合成产物及催化效率，在体外验证SDRs催化丹参酮生物合成的功能。本项目为解析具有药用价值丹参酮的生源途径提供新思路，对植物高氧化次生代谢产物合成途径研究具有重要示范意义。

丹参酮能有效治疗心脑血管疾病，其生源途径解析主要关注CYP450氧化酶。本项目提出短链脱氢酶SDRs催化丹参酮生物合成的学术假说。揭示丹参酮生物合成关键酶短链脱氢酶编码基因的作用机制，解析丹参酮的生物合成途径，有助于高品质丹参新种质的选育。本项目完成染色体水平的丹参基因组，鉴定唇形科与胡麻科共享的全基因组复制事件；通过基因共表达及基因簇系统筛选与丹参酮生物合成相关的SDRs、CYP450s和2OGDs等氧化酶编码基因家族；建立了丹参CRISPR-Cas9基因编辑体系，通过基因干扰及体外酶活鉴定候选SDR的功能。本研究通过高质量丹参基因组挖掘到丹参酮生物合成骨架酶及修饰酶的基因簇，为全面解析丹参酮生物合成途径奠定基础；筛选及鉴定的丹参酮生物合成关键酶编码基因为丹参优良种质的分子辅助育种提供重要的分子标记；建立的CRISPR/Cas9基因编辑体系为丹参酮生物合成途径的精准解析及优质丹参新品种的遗传获取提供重要的科技支撑。