新疆南疆绵羊戊型肝炎病毒感染性克隆的构建与表达研究

戊型肝炎(hepatitis E,HE)是近年来发现新型的人兽共患病,世界各国多种动物均有戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）感染的报道。新疆南疆是HE的高发区，当地绵羊普遍存在HEV感染的状况，其感染率高达32.25%，HE已经成为当地不可忽视的公共卫生问题。本研究采用RT-nPCR和RACE技术，通过克隆新疆南疆地区绵羊HEV的全基因序列，以对本地区流行的优势毒株进行基因分型，并阐明绵羊戊型肝炎病毒遗传演化的规律；在全基因序列分析的基础之上，进一步通过反向遗传操作的途径，采用重叠PCR技术构建本地区绵羊戊型肝炎病毒分离株的感染性克隆，并在A549和HepG2培养细胞中进行表达研究。本项目的开展为下一步揭示绵羊戊型肝炎病毒的致病机理等部分分子生物学特性，研制以感染性克隆为载体的基因工程重组疫苗打下基础。

本研究以新疆南疆地区绵羊作为主要检测对象，分别使用北京万泰生物药业有限公司生产的戊型肝炎抗原试剂盒和动物用戊型肝炎抗体试剂盒，采用酶联免疫吸附试验法（ELISA），检测采自新疆南疆阿克苏、库尔勒、喀什以及和田地区的绵羊血清2700份，采用逆转录套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法检测绵羊粪便2400份、胆汁400份、肝脏300份，并对戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV) RNA阳性的PCR产物进行克隆测序及遗传演化分析。同时，采用北京万泰生物药业有限公司生产的戊型肝炎抗原试剂盒、动物用戊型肝炎抗体试剂盒和人用戊型肝炎抗体试剂盒，检测阿克苏、库尔勒、喀什以及和田地区的猪血清1660份（3月龄以上猪血清1000份，3月龄以下猪血清660份）、牛血清1110份、天山马鹿血清410份、鸡血清1800份、犬血清160份、普通人群血清299份、职业人群血清1421份（其中，屠宰工人血清65份、家畜及肉品销售人员血清126份、餐饮服务人员血清650份、超市服务人员血清580份）。结果表明，新疆南疆地区绵羊HEV感染率达到30%（810/2700），感染率相对较高，绵羊血清中没有检测到HEV抗原存在，粪便和胆汁中也没有检测到HEV RNA，肝脏样品中检测到4株HEV毒株，系统进化分析表明，4株HEV毒株与基因Ⅳ型HEV的同源性最高，属于4d亚型，分离毒株不能在A549和HepG2等细胞上有效培养；猪、牛、天山马鹿、鸡、犬、普通人群以及职业人群的HEV抗体阳性率依次为53.25%（884/1660）、7.03%（78/1110）、32.4%（133/410）、1.56%（28/1800）、13.13%（21/160）、9.03%（27/299）、29.06%（413/1421），检出HEV Ag阳性的猪血清样品26份。本研究从基因水平佐证绵羊是感染HEV的又一宿主，绵羊HEV具有感染人的可能性，并进一步相对系统地摸清了戊型肝炎在新疆南疆地区动物和人群中的分布情况，为人畜共患戊型肝炎的防控起到预警作用。