减数分裂程序性DNA双链断裂产生相关蛋白质筛选

The recognition, pairing, synapsis and recombination between homologous chromosomes, which ensure the correct chromosome segregation in meiotic metaphase I, are the basic features of meiosis. The accurate segregation of homologous chromosomes mainly depends on the programmed DNA double strand breaks (DSBs)generated in leptotene stage of meiosisⅠprophase . Two kinds of proteins are known to be responsible for the initiation of programmed DSB, with one to decide the formation of DSB,such as SPO11, and the other to regulate the sites and numbers of DSBs,such as PRDM9. In lower organisms like budding yeast and fission yeast, 14 and 13 proteins were found respectively,compared with 4 proteins in mice. Thus,it is intriguing to explore which proteins participate in the initiation of programmed DSB except the four known ones and what the functions of these proteins are. In this research, we will search for the proteins differentially expressed between the testes of Spo11 knockout mice and wildtype mice during the first spermatogenic wave by liquid chromatography-mass spectrometry techniques.These proteins will then be sorted by bioinformatics analysis , expression and localization test, protein-protein interactions with proteins that are known to be critical for DSB initiation as well as in vivo examinations using germ cell specifical knockout mice. Through these experiments, we hope to find several new functional proteins associated with programmed DSB initiation and study their functions in meiosis, which may finally bring new insights for researches on the pathogenesis of infertility as well as new tagets for its therapy.

同源染色体的相互识别、配对、联会及重组是减数分裂的核心事件，也是减数分裂同源染色体正确分离的基础，其准确进行则依赖于程序性DNA双链断裂（DSB）的存在。参与减数分裂程序性DSB形成的蛋白质有两类，一类决定DSB能否形成，如SPO11；另一类调控DSB形成的数量及位置，如PRDM9。在低等生物如芽殖和裂殖酵母中，已分别发现14和13种决定减数分裂程序性DSB产生的蛋白，而在哺乳类如小鼠中仅发现4种。那么小鼠还有哪些蛋白质、以及如何决定/调控减数分裂程序性DSB的产生？ 本研究拟用液质联用技术，寻找在第一波生精波中Spo11敲除和野生型小鼠睾丸间差异表达的蛋白质；并利用生物信息学、表达定位、与已知DSB产生关键蛋白间的相互作用分析和条件性基因敲除小鼠等手段，对其进行筛选，以期发现一批新的减数分裂程序性DSB产生功能蛋白，并研究其功能，为相关不育症患者发病机制的探索和诊治提供新思维、新靶点。

减数分裂的正常进行取决于同源染色体正常的配对、联会、重组及正常分离，而这些事件的完成都依赖于程序性DSB的形成。以小鼠为模型，发现减数分裂前期程序性DSB产生相关蛋白质并研究其作用机制，不但有助于阐释减数分裂程序性DSB产生的分子基础和调控机制，也可为了解人类相关不育症的发病机制、实现准确诊治提供理论指导和侯选分子。因此，我们利用蛋白质组学及生物信息学等手段，结合精母细胞表面微铺展和减数分裂遗传重组等技术，以DSB形成和修复相关基因敲除小鼠为模型，寻找与减数分裂程序性DSB形成相关因子。.通过蛋白质组学等方法鉴定了基因敲除小鼠和野生型小鼠睾丸的蛋白质谱，并利用新开发的基因分析注释的数据库- Meiosis Online，对鉴定的蛋白按照功能和表达定位信息进行了分类和注释。在此基础上，结合睾丸组织转录组和小RNA测序，我们发现了①已知的DSB产生修复相关蛋白ATM、SOS1、SUN1；②潜在DSB产生修复相关蛋白Ube2i、GM960等。同时，我们利用自主开发的小RNA组学数据分析工具DeAnnIso对Spo11敲除小鼠和野生型小鼠睾丸小RNA测序数据进行分析发现，Spo11敲除小鼠睾丸中有更多的3’端增加和序列内部编辑的miRNA异构体isomiRs，如其中一例种子序列中存在“A-G”替换的isomiR - iso-miR-30a-5p可以特异性的识别Spo11介导DSB产生和修复过程中的关键组分DNA聚合酶 β（Polb）。此外，我们制备了Gm960的敲除小鼠，发现Gm960敲除后小鼠不育，小鼠睾丸明显变小，精母细胞染色体联会异常，无法产生DSB，产生类似Spo11敲除的表型。综上所述，我们的研究不仅首次提出了DSBs修复相关蛋白新的表达调控机制，而且发现了新的DSBs产生关键蛋白-Gm960，并在小鼠模型中对其功能进行了深入研究，为了解人类相关不育症的发病机制提供理论基础，为不育症患者的分子诊断和对症治疗提供新的候选分子和潜在靶点。