C11orf80移码突变在巴基斯坦婚配家系中导致无精子症和原发性卵巢功能不全的研究

Azoospermia and primary ovarian insufficiency (POI) are the most serious cases of human infertility. However, little is known about the common molecular basis and mechanism of these diseases. Through whole exon sequencing and bioinformatical analysis, we detected a homozygous frameshift mutation (c.483dupT) in the infertile offspring from a Pakistani consanguineous family. We generated mice carrying the same mutation. Preliminary studies showed that homozygous mutant mice are infertile due to defective gametogenesis. Furthermore no RPA foci were found in spermatocytes from the male mutant mice. Based on these results, we hypothesize that the mutation we detected in C11orf80 may block the formation of programmed DSBs and lead to failure of homologous chromosome pairing and synapsis, which consequently result in azoospermia and POI. In this project, we will intensively study the impact of this mutation on gametogenesis and investigate the molecular mechanism for the defects in gametogenesis caused by this mutation. Based on these studies, we will elucidate the mechanism of azoospermia and POI caused by C11orf80 mutation and provide a novel molecular marker for genetic diagnosis of human infertility and embryos from assisted reproductive technology.

人类不育不孕以无精子症和原发性卵巢功能不全最为严重，但对其共同的分子基础和机制，仍了解甚少。我们用全外显子测序和生物信息学分析在巴基斯坦近亲婚配所生的不育子女中，发现了C11orf80纯合移码突变（c.483dupT），并制备了携带该突变的小鼠。初步研究发现纯合突变小鼠雌雄均不育、配子发生异常、精母细胞无DNA单链结合蛋白RPA着色。因此我们推测：C11orf80突变导致减数分裂程序性DSB不能形成，进而引起同源染色体不配对、不联会，减数分裂停滞于偶线期，最终诱发无精子症和原发性卵巢功能不全。为此，拟开展以下工作：1）深入研究该突变在配子发生的具体作用；2）探讨其导致配子发生异常的分子机制。以期阐明C11orf80突变导致人类无精子症和原发性卵巢功能不全的机理，为相关不育症患者基因诊断和人工辅助生殖胚胎遗传诊断提供分子标志。

减数分裂是有性生殖生物产生单倍体配子的一种特殊细胞分裂，其异常是导致人类不育的重要原因之一。减数分裂I染色体的正确分离依赖于同源重组形成的交叉。而减数分裂同源重组起始于由拓扑异构酶VI复合物蛋白SPO11和C11orf80（TOP6BL）催化产生的程序性DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB），其形成失败往往导致小鼠减数分裂停滞和不育。然而，程序性DSB的产生方式在人类和小鼠中是否保守以及DSB形成缺陷是否导致人类不育尚不清楚。. 在本项目中，我们利用全外显子组测序从一个包含三位非梗阻性无精子症男性和一位女性不育患者的巴基斯坦近亲婚配家系中发现了DSB形成基因C11orf80的一个纯合突变（c.483dupT）。Sanger测序结果显示该突变与家系中的不育表型共分离。酵母双杂交结果表明突变后的C11orf80（p.E162*）不能与SPO11β互作。随后，我们对一位男性患者的减数分裂进行分析，发现其同源染色的联会严重异常，偶线期精母细胞比例高达80.72%，而没有粗线期精母细胞。进一步研究发现，患者精母细胞的染色体轴上没有RPA和DMC1信号。这些结果表明男性患者的不育是由于减数分裂程序性DSB形成失败，进而导致同源染色体联会异常和减数分裂在粗线期之前停滞。为了确认C11orf80纯合突变确实是导致患者不育的致病突变，我们利用CRISPR/Cas9技术制备了携带类似患者突变的C11orf80突变小鼠模型。通过对小鼠模型的功能研究，我们发现C11orf80纯合突变雄鼠重现了家系中男性患者的不育表型。更重要的是，C11orf80纯合突变雌鼠虽然也没有形成程序性DSBs，但卵母细胞发育可以通过减数分裂I前期，并停滞于中期I。纯合突变的卵母细胞不能形成二价体染色体，且94.8%的中期I卵母细胞无法排出第一极体。此外，C11orf80突变雌鼠的卵母细胞和卵泡数目随年龄增加而减少，表现为原发性卵巢早衰。. 综上所述，我们的研究不仅证明了C11orf80蛋白在人类和小鼠减数分裂程序性DSB形成中的保守作用，而且直接证明了C11orf80纯合突变（c.483dupT）破坏了程序性DSB的产生，进而导致减数分裂停滞和两性不育。同时，我们的研究深化了人们对不育的分子基础的认识，并为不育的临床诊治提供了新靶标。