人工锌指转录因子激活猪体细胞内源多能因子诱导iPS细胞的研究

诱导多能干细胞（iPS）在疾病治疗、基因功能研究及分子育种方面具有重要意义。目前常用的病毒介导iPS细胞诱导方法存在外源基因整合导致安全性问题，限制了该技术的广泛应用。本项目拟利用人工锌指蛋白转录因子激活体细胞内多能因子，诱导生成无外源基因插入的iPS细胞。通过构建天然锌指多肽库，借助开源方式和细菌双杂交方法设计筛选能够特异识别细胞多能因子基因（Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc）启动子的锌指蛋白，构建能够识别激活多基因启动子的人工锌指转录因子（ZF-VP16）真核表达载体，转染猪体细胞，激活细胞内源多能因子，检测对细胞重编程的影响以及在诱导生成iPS细胞中的作用。本研究首次提出应用特异性人工锌指转录因子，激活体细胞内源性多能因子基因探索对体细胞重编程和诱导iPS细胞生成的影响。期望开发出一种安全高效的iPS诱导体系，为iPS研究提供一种新方法。

诱导多能干细胞（iPS）在疾病治疗、基因功能研究及分子育种方面具有重要意义。目前常用的病毒介导iPS 细胞诱导方法存在外源基因整合导致安全性问题，限制了该技术的广泛应用。本项目首次提出应用特异性人工锌指转录因子，激活体细胞内源性多能因子基因探索对体细胞重编程和诱导iPS 细胞生成的影响。期望开发出一种安全高效的iPS 诱导体系，为iPS 研究提供一种新方法。在项目实施过程中，我们先后建立了锌指核酸酶酵母筛选系统、锌指蛋白细菌单杂交筛选系统、锌指转录因子酵母单杂交筛选系统；开发了TALEN/TALETF Golden Gate快速组装技术，基于IIs型内切酶的多位点突变技术；建立了完善的CRISPR/Cas9技术平台；最终尝试开发了锌指转录因子、TALE转录因子和CRISPR/Cas9转录因子；这些为以后继续进行人工诱导iPS的研究奠定了基础。.