马铃薯腐烂茎线虫耐低温相关基因克隆与功能分析

The potato rot nematode, Ditylenchus destructor Thorne could cause severe damage to sweet potato in north China. Tolerance to low temperature is one of the key factors for the successful invasion and infection of this nematode. The cold tolerance mechanism of D. destructor is not well documented so far. In order to understand the molecular mechanism, the transcriptome of D. destructor treated at different low temperature will be sequenced using Illumina technique, and the functional annotations and metabolic pathways analyses of unigenes will be conducted. The full sequence of some genes that related to cold tolerance of D. destructor will be cloned by RACE methods. Gene characteristics will be studied by In situ hybridization, Real-time PCR analysis and Southern blot analysis. In order to understand how these genes respond to cold stress in D. destructor, gene and protein functions will be studied by molecular techniques such as RNA interference, prokaryotic expression and Western blot. This research will provide the foundation and theoretical basis for developing new strategy of nematode control in sweet potato production.

由马铃薯腐烂茎线虫危害造成的甘薯茎线虫病是我国北方薯区的重要病害，对低温的耐性是该线虫成功传播和侵染为害的关键因子。目前对该线虫抗寒机制尚不清楚。本研究以筛选得到的马铃薯腐烂茎线虫耐低温种群为材料，对不同低温胁迫条件下的马铃薯腐烂茎线虫进行转录组分析，筛选马铃薯腐烂茎线虫应答低温胁迫相关基因，并对部分基因进行克隆，确定其拷贝数，利用Real-time PCR及原位杂交技术分析在不同虫态中目的基因的表达特性，运用RNAi技术对相关基因功能进行分析，通过western-blot检测目的基因蛋白在不同处理线虫中表达量的差异，以原核表达技术验证目的基因蛋白活性，从而确定低温胁迫过程中相关基因在线虫抗寒性形成中的作用，获得一批对马铃薯腐烂茎线虫低温抗性具有调控作用的新基因，为了解马铃薯腐烂茎线虫应答低温胁迫的分子机制，在分子水平开展马铃薯腐烂茎线虫防治新策略研究奠定基础。

甘薯茎线虫病是制约我国甘薯生产的主要病害之一，在我国的南北薯区均有发生，近年来已上升为我国北方薯区最严重的病害。其病原为马铃薯腐烂茎线虫 (Ditylenchus destructor)，又称甘薯茎线虫。环境温度对线虫的生命活动具有重要的影响作用，线虫对低温的耐受力是决定其在自然条件下存活和分布的重要因素。迄今为止，对马铃薯腐烂茎线虫温度耐受力的分子调控机制知之甚少。开展马铃薯腐烂茎线虫对低温胁迫的适应能力研究，明确其抗逆性形成机制，可为制定相应的防治措施提供理论依据。本研究对马铃薯腐烂茎线虫的耐低温能力进行了测定。利用高通量测序技术平台 Illumina对不同低温条件胁迫和非胁迫条件下马铃薯腐烂茎线虫样品进行转录组测序。共完成10个样品的转录组测序。对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得58,453条Unigene的注释结果。进行基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,463个SSR标记，同时还进行了CDS预测和SNP分析。对所试不同样品转录组数据进行比较分析，得到差异基因18587个。对所得差异基因进行了功能注释、富集分析和层次聚类分析。对19个低温处理后大量表达的基因进行了 RT-qPCR分析, 结果与转录组测序得到的结果一致。分别对马铃薯腐烂茎线虫低温抗性相关基因U15597，GUT1，UNC38，Heml1, a3和HSP21基因进行了全长扩增，并利用RNAi技术初步分析了这些基因的功能。对分别编码热激蛋白HSP21、Fatty acid desaturase、gut esterase等的6个基因进行Southern杂交分析。杂交结果显示马铃薯腐烂茎线虫中存在该基因，且为多拷贝基因。原位杂交结果显示HSP21及a3基因在马铃薯腐烂茎线虫的多个部位有明显杂交信号。对Heml1和hsp21基因构建原核表达载体，IPTG诱导表达，通过SDS-page和western blot分析验证了目的蛋白的表达。本研究揭示了马铃薯腐烂茎线虫低温处理过程中转录组水平上的复杂变化，为更深一步研究线虫低温抗性的分子调控机制提供了基础。