马铃薯腐烂茎线虫VGCC的功能和药理学分析

Voltage-gated calcium channels (VGCC) are membrane protein complexes consisting of a pore-forming, voltage-sensing α1 subunit and other auxiliary subunits, such as β ,α2/δ and γ subunits. These channels provide the pathway for Ca2+ influxes that underlie a multitude of intracellular processes, such as gene regulation, neurotransmission and muscle contraction. However, in plant parasitic nematodes, little is known about their function and pharmacology properties. In this project, various VGCC subunits from Ditylenchus destructor will be cloned, and the expression location and biological function of VGCC subunits will be characterized by using mRNA in situ hybridization, in vitro RNAi and Fusarium semitectum mediated in vivo RNAi. L-, P/Q-, and T-type VGCC of D. destructor will heterogenously expressed in human embryonic kidney (HEK) 293 cells, and electrophysiological and pharmacological properties of transfected HEK293 cells will be observed using whole-cell patch voltage clamp technique. The results will add to our understanding of the structure & function of VGCC in plant parasitic nematode, support us to explore novel nematicides.

电压门控钙离子通道（VGCC）是一种镶嵌于细胞膜上的大分子蛋白复合体，由成孔、具有电压传感特性的α1亚基和辅助性β、α2/δ和γ亚基组成，介导细胞钙离子内流，在基因表达、神经递质的释放和肌肉收缩等生命活动中发挥重要的生理作用。目前对植物线虫VGCC的功能和药理学特性还知之甚少。为此，本研究拟对马铃薯腐烂茎线虫的VGCC各亚基基因进行克隆，通过原位杂交技术对VGCC各亚基的mRNA进行表达定位分析，并采用离体和半裸镰刀菌介导的活体RNAi技术对VGCC各亚基进行生物学功能分析；分别在HEK 293细胞异源表达L型、P/Q型和T型 VGCC，并在全细胞电压钳模式下测试各转染细胞系的电生理和药理学特性。研究结果有助于揭示植物线虫VGCC的结构和功能，为开发新型杀线虫剂提供理论基础。

电压门控钙离子通道（VGCC）是一种镶嵌于细胞膜上的大分子蛋白复合体，由成孔的α1亚基和辅助性β、α2/δ和γ亚基组成，介导细胞钙离子内流，在基因表达、神经递质的释放和肌肉收缩等生命活动中发挥重要的生理作用。目前对植物线虫VGCC的生物学功能还知之甚少。本研究以马铃薯腐烂茎线虫为材料，采用用RT-PCR和RACE技术克隆得到了马铃薯腐烂茎线虫3种不同类型VGCCα1亚基基因的cDNA序列，通过序列比对和生物信息分析，发现DdCα1D、DdCα1A 、DdCα1G分别具有L型 (CaV1) 、non-L型 VGCC(CaV2) 和T型VGCC (CaV3)的功能结构域及保守序列，并进一步克隆获得了DdCavβ和DdCavα2δ的cDNA序列。通过荧光定量PCR分析了各亚基基因的时空表达；通过原位杂交明确了DdCα1D基因主要表达于体壁组织；DdCα1A基因主要表达于食道腺、阴门和输精管部位；DdCα1G基因主要表达于食道和中食道球部位；DdCavβ基因表达于线虫的全身组织；DdCavα2δ基因则主要表达于线虫的体壁组织、食道腺、雌性子宫与后阴子宫囊以及雄虫交合刺等部位。.通过RNAi分别对马铃薯腐烂茎线虫DdCα1D、DdCα1A、DdCα1G和辅助亚基DdCavα2δ、DdCavβ进行沉默和多靶标基因共沉默的方法，分析了各亚基的生物学功能。结果表明，L型VGCC可影响线虫的运动、趋化性和口针收缩，Non-L型VGCC可影响线虫的摄食、蛋白分泌与繁殖，T型VGCC可影响线虫的摄食和繁殖，且辅助亚基DdCavβ、DdCavα2δ对线虫的L型和Non-L型VGCC相应的生物学功能具有辅助作用。同时，单独沉默DdCavα2δ亚基基因也可影响线虫的运动、趋化性与繁殖。.本项目揭示了马铃薯腐烂茎线虫VGCC的结构和功能，为进一步研究植物线虫VGCC的作用奠定了基础。