可控酶解制备寡肽过程中肽谱变化规律的研究

Oligopeptides, with a molecular weight range from 200 to 1200 Da, have high nutritive value and great health function. They are mainly prepared by the method of enzymatic hydrolysis, which has the advantage of green and safety. How to choose appropriate protease and effectively control the hydrolysis process are the keys for oligopeptide preparation. However, for most proteases used in food industry, their hydrolysis specificity was still unclear and there is no systemic research on the changing rules of the peptide maps (peptide sequences and abundance) in the ultrafiltration-coupled enzymatic hydrolysis. So it is difficult to make a selection of the proteases with superior characters in the process of controllable hydrolysis, let alone developing an optimized peptide-producing procedure. In the present research, the hydrolysis specificities of three kinds of frequently-used food proteases (Acid protease of Aspergillus niger, Neutral protease of Bacillus subtilis and Alkaline protease of Bacillus licheniformis) were investigated based on a library of peptide maps constructed by enzymatic hydrolysis of many kinds of proteins, which will provide fundamental basis for the selection of proteases. In addition, the variation rules of the peptide maps in the ultrafiltration-coupled enzymatic hydrolysis will be also investigated for the optimization of controllable hydrolysis. It will help to break through the bottleneck of oligopeptide preparation and has great significance for promoting the comprehensive utilization of protein resources.

分子量范围在200～1200 Da的寡肽具有突出的营养价值和保健功能，目前主要是通过绿色、安全高的酶解法获得。如何选择合适的蛋白酶和有效地控制酶解过程，是寡肽制备的关键。而目前由于多数食品蛋白酶的水解特性和规律仍不明确，而且其研究方法以短肽水解为基础，影响了特定蛋白水解时酶的理性选择。另外，尽管通过膜分离和酶解偶联发展了可控酶解技术，但是目前对于其过程中肽谱（多肽的序列和丰度）的变化规律仍不清楚，制约了寡肽制备的水平。本项目首先建立酶切特性未知条件下的肽谱分析方法，然后通过多种蛋白水解构建的肽谱库研究和比较三种常用食品蛋白酶（黑曲霉酸性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶）的水解特性，并通过比较间歇式和超滤偶联式酶解研究肽谱在可控酶解过程中的变化规律，从而为酶的选择和可控酶解的优化奠定理论基础。该研究对于突破寡肽制备的技术瓶颈和促进我国蛋白资源的高效利用具有重要的意义。

分子量范围在200～1200 Da的寡肽具有突出的营养价值和保健功能，其主要是通过绿色高效的蛋白酶水解法获得。但是，目前对于多数工业蛋白酶水解肽谱的特性和规律仍缺乏认识，制约了工业蛋白酶的理性选择和高效应用。并且，对工业蛋白酶水解肽谱的研究，目前尚缺乏适合的肽谱分析方法。另外，目前寡肽制备主要采用蛋白酶分批酶解的方式，酶解过程缺乏可控性，寡肽含量较低。鉴于这些问题，本项目首先针对工业蛋白酶水解肽谱的分析，探索建立了非特异性酶切肽谱分析方法，并通过评估证明了其可靠性；在此基础上，分别通过对标准蛋白底物和复杂混合蛋白的水解，研究了三种工业蛋白酶水解肽谱的动态过程和规律，结果显示蛋白酶对不同氨基酸位点酶切的频率差异较大，表明工业蛋白酶在水解位点上具有宽泛的选择性和一定的倾向性，其中2709碱性蛋白酶对大豆蛋白的水解更倾向于在组氨酸、天冬酰胺和赖氨酸的C端、苏氨酸和丙氨酸的N端发生酶切。最后，建立了超滤偶联可控酶解制备寡肽的方法，研究了膜孔径、预酶解时间等因素对寡肽制备的影响，通过与分批式酶解的比较证明了偶联酶解在寡肽制备上的优势，将寡肽含量由低于40%提高到了60%以上。本项目的研究成果，对于提升我国蛋白酶应用水平，突破寡肽制备的技术瓶颈和促进我国蛋白资源的高效利用具有重要意义。