p66Shc介导皮肤细胞SIPS进程中线粒体信号通路的分子机制研究

本课题组发现皮肤细胞经亚毒剂量UVB反复辐射后可进入应激性早衰（SIPS）状态，出现Redox蛋白p66Shc的活化和上调，伴之以线粒体DNA的大片段缺失突变和叉头蛋白家族成员FKHRL1的活化。研究已初步证实p66Shc介导了一条全新的氧化应激-线粒体功能通路，但具体调控模式及作用网络亟需进一步明确。本研究拟以皮肤细胞SIPS模型为基础，以衰老相关酶表达、细胞凋亡/增殖、氧化应激状态为衰老表型观察指标，构建p66Shc靶向的siRNA表达载体pRNATU6.1/p66Shc-siRNA，检测p66Shc-/-皮肤细胞SIPS进程中衰老表型和线粒体结构/功能改变，并以aRNA芯片筛选通路中的差异表达基因，然后以免疫共沉淀和免疫印迹法验证p66Shc-线粒体信号通路中的相关作用蛋白，在分子水平阐明p66Shc及其介导的氧化应激通路在皮肤细胞SIPS进程中的作用，并发现新的抗衰老作用靶点。

氧化应激是ROS过度生成和抗氧化防御失衡的细胞损伤病理过程，广泛存在于肿瘤、炎症、中毒、创伤、缺氧、缺血/再灌注损伤和衰老过程中。阐明其相关的信号通路，不仅有助于明确衰老这一重大生命事件的发生机制，而且有助于揭示其他病理性事件（如细胞凋亡、细胞坏死和肿瘤发生）的病变机制。新近研究发现，氧化还原（Redox）蛋白p66Shc可能介导了一条全新的线粒体信号通路，在氧化应激和细胞衰老过程中发挥的作用令人关注。但这条通路在细胞衰老过程中所承担的功能，及其调控细胞线粒体功能和氧化应激相关信号的分子机制，目前尚不清楚，需要进一步的相关研究。.本课题第一部分成功构建了干扰真核表达质粒pGPU6/ p66Shc-siRNA，建立了稳定感染并表达p66Shc-siRNA的HEKa细胞系，观察了该HEKa细胞系衰老表型的改变，揭示了p66Shc 在HEKa氧化应激反应调控中的作用、机制和主要调控靶点，为抗衰老领域提供新的治疗靶点。 .本课题第二部分观察了pGPU6/ p66Shc-siRNA对SIPS状态HEKa增殖、凋亡以及线粒体功能的影响，通过高通量芯片筛选出高度相关的下游靶基因TP53INP1基因，拓展了抗衰老治疗的新思路并有助于发现新的研究热点。