利用小分子探针研究CD38的膜拓扑学

CD38 is a trans-membrane protein ubiquitously expressed in virtually all mammalian tissues. Two decades of work has revealed that it is a novel signaling enzyme responsible for synthesizing and metabolizing cyclic ADP-ribose (cADPR), a novel Ca2+ messenger discovered by us that modulates the channel activity of the ryanodine receptor and mobilizes the endoplasmic Ca2+ stores. Gene knockout studies have established that CD38 regulates a wide range of physiological functions, from insulin secretion, susceptibility to bacterial infection, to social behavior of mice through modulating neuronal oxytocin secretion. We have elucidated the mechanism of how it catalyzes the multiple reactions responsible for metabolizing cADPR to atomic resolution by X-ray crystallography. How CD38 is endogenously regulated, however, remains largely unexplored. One of the main unresolved issue centers on its membrane topology. CD38 has long been thought to have a type II membrane orientation with the catalytic C-domain facing outside. It has never been fully understood how an ecto-enzyme can gain access to its intracellular substrates, NAD, and produce the signaling messenger, cADPR that target intracellular Ca2+ stores. The main focus of this application is to elucidate this topological paradox of CD38 and to provide long sought insights into the endogenous regulatory mechanisms of this novel Ca2+ signaling enzyme. The specific Aims are:.1. Generation of membrane permeant antagonist of CD38..2. Generation of specific antibodies for Type III CD38..3. Topology of CD38. 3.1.intracellular nanobody for type III CD38.. 3.2.BiFC using nanobody-VenN and CD38-VenC.. 3.3.G4S for staining and immunoprecipetation of type III CD38..4. Determinants of CD38 topology. Positively-charged residues, serines and cysteines.5. Lipid content and CD38 topology.

钙离子活动对于几乎所有的细胞功能都是非常重要的。我们早前发现了两条全新的钙离子相关的信号通路：cADPR和NAADP信号通路，而且发现CD38是哺乳动物细胞合成这两个信使的关键酶。但是CD38的拓扑学悖论——活性结构域和底物/产物靶位位于生物膜的异侧——一直阻碍着人们对这条通路的深入认识。为了解决这个悖论，我们提出了“III型CD38”存在假说，并利用针对CD38氨基端的特异性抗体首次观测到了细胞表面的III型CD38。本项目将从以下三个方面去进一步论证它的分布和可能机制。它的顺利进行不仅可以为细胞内钙离子信号转导提供研究工具，而且可以为该新型通路的内在调节机制提供有价值的见解。.目标1、设计膜通透性拮抗剂来研究CD38的拓扑学方向；.目标2、设计胞内表达的纳米抗体研究III型CD38的分布；.目标3、脂质电荷对CD38拓扑学方向的影响。

CD38是一个淋巴细胞的表面蛋白，它的表达与细胞发育和分化相关；另外，作为表面分子，CD38与其他抗原，例如CD4等相互作用，保护细胞免受HIV的感染。我们课题组在多年前发现了CD38的ADP核糖环化酶活性，从此开创了一个研究CD38信号酶功能的新领域。该领域发展至今，有一个不得不解决的拓扑学问题：即解释催化活性区位于胞外的酶，催化生成胞内第二信使物质的机制。为解决这个问题，我们提出了III型CD38的假说，即有部分CD38存在催化结构域朝向胞内的形式。.针对上述假说，我们从以下几个方面开展了研究工作：.1. 设计并制备膜通透性CD38的拮抗剂，CZ27-AM。通过向CD38的极性拮抗剂CZ27上引入酯基-AM基团，增加该拮抗剂的膜透性，并使其在胞质内富集，特异性抑制胞内CD38的活性。本部分化学合成工作已完成，活性测试发现CZ-27-AM对多发性骨髓瘤LP-1细胞的CD38活性有抑制作用，导致胞内cADPR水平下降。.2. 选择CD38的第四个糖基化位点，制备了特异针对非糖基化多肽的抗体，因此它只能识别非糖基化的III型CD38，因为II型CD38的表位被糖链阻断。利用该抗体，我们系统研究了CD38 N端的正电氨基酸、可能被磷酸化的丝氨酸以及可能被棕榈酸话的半胱氨酸对于CD38膜拓扑学的决定作用。该部分的工作最近已经发表在期刊Biochim Biophys Acta.（2015 Sep;1853(9):2095-103）上，并获得同行在F1000Prime推荐。.3. 制备了一系列CD38的纳米抗体，并获得了它们与CD38复合物的晶体结构，鉴定了三个表面抗原决定簇以及相应的纳米抗体。利用这些抗体，构建了胞内抗体以及双分子荧光互补技术（BiFC）抗体对，来识别胞内III型CD38。部分结果已经整理，投稿中。.4. 研究质膜脂质成分对CD38拓扑学方向的作用。.采用带有功能性微粒体的体外翻译系统，根据糖基化和蛋白酶敏感性判断CD38朝向；然后改变微粒体中PI或PE的成分观察CD38朝向变化。本部分内容尚未完成，遇到的困难是体外翻译系统建立不成功，现正尝试细菌表达体系。.在项目执行期内，课题在原定方向都取得了突破，特别是CD38拓扑学方向决定性因素方面的成果已得到发表并获得同行认可。.该课题有助于阐释CD38信号作用机制，深化对其相关生理病理作用的认识。