非整倍体介导白念珠菌对卡泊芬净耐药的分子机制研究

Echinocandins such as caspofungin are the first line drugs for candidiasis. We found lethal dose of the 'fungicidal' caspofungin did not kill all the cells of C. albicans. The survivors usually had altered copy number of particular chromosomes and obtained resistance to caspofungin. Calcineurin pathway was required for caspofungin survival. SOD5, DDR48 and RTA2 were required for copy number change of particular chromosomes. Sphingolipid pathway inhibitors were synergistic with caspofungin. Thus, we propose aneuploidy formation is the major mechanism of caspofungin tolerance in C. albicans. We propose aneuploids are 'mutators' which accelerate the mutations to higher level of drug resistance. In this study, we will analyze whether this is a widespread mechanism. We will use in vitro and in vivo experiments to test the effect of aneuploidy on the evolution of drug resitance. And we will use high throughput method to screen for chemicals targeting the aneuploids.This study illustrates a novel mechanism of drug resistance in C. albicans, and sheds a new light on the study of drug resistance in other eukaryotic cells as well as cancers.

以卡泊芬净为代表的棘白菌素类药物是治疗白念珠菌感染的一线药物。我们发现致死剂量卡泊芬净并不能杀死全部的白念珠菌，存活菌通常发生染色体拷贝数变异（非整倍体）并且具有耐药性。因此，我们认为非整倍体的形成是白念珠菌耐受卡泊芬净的首要机制，非整倍体变异通过其‘突变加速器’的作用加快更高水平耐药性的出现。本课题将考察白念珠菌耐卡泊芬净的非整倍体变异表型及其特性，并验证在其他念珠菌属中是否也普遍存在；进一步通过考察非整倍体变异前后白念珠菌特定基因或信号通路的变化及其对耐药性的影响，阐明白念珠菌非整倍体变异介导其耐药的调控机制及关键调控基因；并利用“进化陷阱”和“反向选择”理论，高通量筛选抗非整倍体耐药株，或抑制非整倍体变异株形成的化合物或中药单体，为阐明真菌耐药机制提供新理论，为克服临床真菌耐药提供新策略，甚至也将为研究其他真核病原体、甚至肿瘤的耐药机制提供新思路。

非整倍体在对化疗药物有反应的肿瘤细胞和适应抗真菌药物的真菌细胞中都很常见。由于非整倍体同时影响许多基因，它有可能赋予同一细胞多种表型。本课题分析了人类最普遍的真菌病原体——白念珠菌在化疗药物和抗真菌药物下获得生存能力的机制。结果显示，对这两类药物的适应伴随着特定的染色体非整倍体的获得，一些非整倍体核型在不同的药物条件下独立、重复发生。具体来说，选择在羟基脲（一种抗癌药物）中生存的菌株获得了对卡泊芬净（一种一线抗真菌药物）的交叉适应性，并且两种获得的性状都归因于同一染色体的三倍体：三倍体的丧失伴随着对两种药物适应性的丧失。从机制上讲，非整倍体同时改变了2号染色体上大多数基因的拷贝数，然而在羟基脲或卡泊芬净中生存需要不同的基因和压力反应途径。同样，染色体五单倍体使其对氟康唑和卡泊芬净的耐受性增加，这些抗真菌药物的作用机制不同。白念株菌在CSP刺激下获得矛盾生长克隆，主要通过形成片段性染色体R单倍体，获得对卡泊芬净和米卡芬净交叉耐受性(即MIC没有变化，但是在点板实验表明其生长能力较亲本增强)。PKC、钙调磷酸酶通路、Tor通路和Hsp90是矛盾生长和卡泊芬净耐受性所必须的，但敲除PKC和钙调磷酸酶通路关键基因后，白念株菌仍能通过非整倍体(染色体五单倍体)获得对卡泊芬净耐受性。交叉适应的潜力是非整倍体本身的特征，还是取决于特定的非整倍体染色体上的特定基因值得研究。本课题结果显示，矛盾生长通过形成片段性染色体R单倍体，可能减少该染色体上的特定基因表达获得对卡泊芬净和其他棘白菌素类药物交叉耐受，矛盾生长和非整倍体介导的卡泊芬净耐受性依赖于PKC, Calcineurin和Tor通路。此外，在系统性念珠菌病的小鼠模型中，预先接触羟基脲增加了卡泊芬净适应株的出现频率，而且羟基脲适应的白念株菌对抗真菌药物治疗是不敏感的。这突出了对有真菌感染风险的癌症化疗患者管理的潜在临床风险。