烟曲霉T-DNA插入突变筛选和分离到的卡泊芬净耐药新基因batA的功能特征和耐药机制研究

Infections and antifungal drug resistant caused by the fungi are a significant clinical issue. Clinical resistances to the new echinocandin caspofungin of fungus have been reported recently. While little is known about mechanisms of drug resistant in fungi, especially potential mechanisms of caspofungin resistance and no clear ATP-binding cassette (ABC) transporter proteins (drug efflux pumps) was found. In our previous study we have screened and isolated a new ABC transporter protein gene by T-DNA random mutation, batA, which involved in caspofungin resistance in Aspergillus fumigatus: both T-DNA mutation strain in forward genetics research and deletion strain of batA in reverse genetics research displayed resistance to caspofungin. To further completely understand the regulation mechanism of batA in caspofungin drug resistance, in this project we will focus on how batA function in caspofungin drug resistance by using replacement of promoter to control its expression, GFP labeling technique to observe its localization, observation of cell wall structure and analysis of cell wall components in deletion strain, detecting gene expression levels of AfFKS1 and HSP90, rhodamine-labeling to verify activity of some unknown drug efflux pump in deletion strain and digital gene expression profile technology to screen the key candidate genes downstream of batA. Moreover, on the basis of results in this study we hope to provide a new insight for the study of fungal resistance mechanisms and reference for foundation of antifungal new drug and improvement of existing therapeutic strategies.

病原真菌耐药性是治疗深度真菌感染所面临的常见问题，目前在临床上已经开始出现抗新型抗真菌药物卡泊芬净的菌株。然而真菌耐药机制的研究还很薄弱，尤其是介导真菌对卡泊芬净等棘白菌素类抗真菌药物产生耐药性的外排泵基因在真菌中目前尚未有明确的研究结果。本项目以烟曲霉为材料,通过T-DNA插入随机突变筛选和分离得到一个卡泊芬净耐药相关新基因ABC转运蛋白基因batA进行深入研究。该基因被T-DNA插入破坏后导致突变菌对卡泊芬净耐药，同时敲除菌株也具有与突变菌相同的耐药表型。本项目下一步将通过外源启动子控制batA的表达，GFP标记荧光定位，细胞壁电镜观察和成分分析，AfFKS1和HSP90表达量检测，罗丹明标记检测潜在的药物外排泵活力，RNA测序寻找下游基因等深入探讨该新基因在烟曲霉中的功能特征和对卡泊芬净产生抗性的分子调控机制，为真菌耐药机制研究奠定基础和发现新药靶并改进现有的治疗策略提供理论依据。

近年来，侵袭性曲霉病感染的发生呈现上升趋势，病死率达 60%-100%。烟曲霉是引起大部分侵袭性曲霉病的主要病原菌。目前治疗深部曲霉感染的临床广泛应用的一类药物是三唑类抗真菌药物以及临床备用药物棘白菌素类抗真菌药。然而已经发现越来越多的临床分离菌对抗真菌药物产生耐药性。烟曲霉出现的耐药原因主要有药靶的突变和药物外排泵的活力升高等原因，目前人们对烟曲霉的致病性和耐药性等还没有深入了解。.前期本研究分离鉴定到Afssn3和batA两个基因突变，分别导致对唑类药物和卡泊芬净药物耐受。.Afssn3基因参与耐受唑类药物的机制是：Afssn3定位在细胞核中反向调节唑类耐受。Afssn3缺失导致1.葡萄糖氨基酸转运体基因上调，进而导致葡萄糖吸收增加，吸收的葡萄糖一部分合成了细胞外多糖基质参与耐药。2.氨基酸转运体基因的上调，进而导致氨基酸的转运和消耗增加，其中的丝氨酸一部分做为鞘脂合成途径中的基础物质合成3-酮基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，植物鞘氨醇在细胞膜上参与耐药；3.药物外排泵基因的上调参与耐药。这三大类物质形成了致密的生物膜系统，最终导致敲除菌细胞内药物比野生型少从而对唑类药物产生抗性。.batA基因参与耐受卡泊芬净药物的机制是： BatA-GFP是定位在菌丝细胞内的空泡上发挥功能。ΔbatA敲除株和OEbatA对卡泊芬净最小抑菌浓度MIC值没有发生明显改变，但是出现抑菌“矛盾现象”的药物浓度分别出现提前和延迟。出现该现象的原因是batA负责转运细胞质中的卡泊芬净到囊泡中，当batA缺失时，卡泊芬净聚集在细胞质中浓度过高，导致菌株提前出现矛盾现象；当batA高表达时，细胞质中的卡泊芬净被大量转运到囊泡中，导致胞质中卡泊芬净浓度低，所以出现敏感和矛盾现象推迟的现象。同时我们还发现谷胱甘肽和卡泊芬净的矛盾现象密切相关，细胞质中谷胱甘肽作为下游物质参与了烟曲霉应对卡泊芬净的矛盾反应。.这些研究部分填补了国内外对于烟曲霉耐药的分子调控机制的研究空白，为控制病原真菌的耐药性和发现新药靶、改进临床上现有治疗策略提供新思路。