冰岛硫化叶菌染色体蛋白甲基转移酶的鉴定及功能分析

Covalent modification of histones plays pivotal roles in modulation of chromatin structure and function. Protein methylation has been observed relatively more ubiquitous in Archaea, including methylation of DNA associated proteins as Cren7 and Sul7d. Nevertheless, there is only one SET family methyltransferase reported in Methanosarcina till now. During our study of Dot1 in Saccharomyces cerevisiae , we found two genes in genomes of Sulfolobales, SiR_1529 and SiR_1419 (as in S. islandicus), which show similarity to yeast Dot1 through PSI-BLAST search. SiR_1529 has been proven to be able to catalyze the methylation of Cren7 in vitro in our preliminary experiments. To further reveal the Dot1-like proteins in Archaea, we propose to characterize the methyltransferases by using the genetically tractable model organism, S. islandicus. Structural and functional analysis will be carried out, in combination of genetic assays to understand the physiological roles of Dot1-like protein(s) and the effects of lysine methylation of DNA binding proteins in Sulfolobus. Through characterization the first protein methyltransferase among Crenarchaea, this project will help to shed new light on the origin and evolution of epigenetics.

组蛋白翻译后修饰在染色体结构与基因转录调控中起着关键的作用。近几年在古菌蛋白(包括Cren7、Sul7d等染色体蛋白)中发现普遍的甲基化修饰现象，但迄今为止仅有极少数产甲烷古菌存在类似SET甲基转移酶的零星报道。通过生物信息学分析，我们在硫化叶菌基因组中发现了两个与Dot1序列相似度较高的基因：在Sulfolobus islandicus 中分别为SiR_1529及SiR_1419。前期实验已初步证明SiR_1529具有体外甲基化活性，能对Cren7等底物进行甲基化。这是迄今为止首次在原核生物中发现Dot1家族基因。本项目拟在此基础上，以冰岛硫化叶菌为研究材料，深入研究硫化叶菌甲基转移酶的性质、结构与作用机制，了解Cren7等染色体蛋白甲基化的生理功能，并探究其甲基化修饰在适应极端环境等过程中可能的作用。本项目旨在揭示泉古菌门首个蛋白甲基转移酶，为表观遗传学的起源与演化提供新的启示

本项目通过三年的研究完成了项目申请书和计划书中的研究内容，并且获得了一些意想不到的新进展。纯化鉴定了首个古菌来源的甲基转移酶aKMT4并分析了其生化特性，并且发现胞内染色质结构的形成能调节它对不同染色质蛋白的修饰活性。此外，我们发现冰岛硫化叶菌的复制解旋酶sisMCM也是aKMT4的底物之一。甲基化修饰能显著增强MCM在高温下的DNA解旋酶活性。..赖氨酸残基的甲基化修饰在古菌中普遍存在，但尚未报道相应的甲基转移酶。我们发现了广泛分布于古菌的赖氨酸甲基转移酶aKMT4，在结构与功能上与真核生物甲基转移酶KMT4/Dot1部分同源，但缺乏特异的底物识别结构域。aKMT4在体外能甲基化一系列与核酸代谢相关的底物，包括类组蛋白Sul7d和Cren7，RNA exosome的组分以及DNA复制解旋酶MCM。aKMT4存在自甲基化现象，可与其它底物竞争甲基基团。发生自甲基化后aKMT4不能把自身的甲基转移给其他底物，当存在甲基供体时自甲基化的aKMT4比未甲基化的aKMT4酶活性降低。aKMT4-8A突变体阻断自甲基化作用并提高了对其它底物的甲基化效率，揭示了aKMT4甲基转移酶活性的自调节机制。DNA的存在显著提高了aKMT4对Sul7d的甲基化效率，但对于Cren7的甲基化却没有影响。质谱结果和动力学分析都证明Sul7d与DNA形成染色质结构后更容易被aKMT4甲基化。这些结构暗示着在细胞内aKMT对不同的染色质蛋白的修饰活性与它们是否形成染色质结构相关。..此外，通过体外一系列底物的筛选我们发现重组的冰岛硫化叶菌复制解旋酶sisMCM在体外能够被aKMT4甲基化。sisMCM是真核生物复制解旋酶核心Mcm2-7的同源蛋白，这也是这一蛋白家族中首次被鉴定到存在甲基化修饰。质谱结果表明，重组sisMCM在体外被aKMT4修饰的位点与从硫化叶菌中纯化的內源MCM的甲基化位点基本一致。在高温条件下，甲基化修饰促进了MCM的解旋酶活性。这些甲基化修饰位点定位在蛋白质表面，很有可能通过对其表面局部疏水性或者电荷的改变来调节分子内或者分子间的相互作用。此外，模拟甲基化突变体具有与甲基化修饰的天然MCM蛋白相似的热稳定性。.. 本项目揭示了原核生物甲基转移酶的可能作用机制，为原核生物可能存在染色体结构动态调控提供了实验证据，也提出了一种可能的极端嗜热微生物适应高温生长环境的新机制。