一种基于蛋白质二级结构模块重组建立基因文库的新方法

酶的定向进化是目前蛋白质工程的重要策略之一，它的一个必须的步骤是建立多样性的突变体文库。借用计算机模块组合的思想，本课题拟建立一种基于模块重组构建DNA随机文库的方法。将目标蛋白质的基本二级结构单元（α-螺旋，β-折叠片，β-转角）作为重组的基本模块，在其两端设计编码柔性氨基酸序列的共用接头序列，利用共用接头的互补连接，用重聚PCR的方法将标准模块进行随机组合，得到一个多样化的DNA文库。为便于筛选，拟以卡那霉素抗性基因的二级结构单元作为模块进行重组建立突变体文库，利用进行抗性筛选来进行方法的检验。本方法的建立克服了目前突变体文库建立方法中点突变多，缺乏序列多样化组合的弊端，可以开拓目标基因更为广阔的序列空间。另外，基于出发点基因的二级结构单元作为重组的基本模块进行DNA序列的组合，所建基因文库中形成有功能突变体的几率较高，在筛选时会有更好的针对性和成功率，提高了筛选的成功率。

酶的定向进化是改变酶的结构和性质，满足工业化需求的有效途径。酶的定向进化成功与否主要取决于所构建的突变文库是否具有足够大的多样性。以易错PCR为代表的随机突变技术和以DNA改组技术为代表的DNA重组技术是目前常用的两种定向进化技术。但易错PCR技术引入的是点突变，获得理想突变体的速度较慢，且目的基因长度较短；而DNA改组技术需要亲本基因的同源性较高。.针对现有构建文库方法的缺点，本课题设计了一种基于蛋白质二级结构模块重组建立基因文库的新方法。为了便于筛选，以卡那霉素抗性基因的二级结构单元为模块进行重组建立突变体文库，通过在琼胶平板上进行抗性筛选来进行建库方法的检验。首先，分析同源性低的卡那霉素抗性蛋白的结构功能信息，选取其二级结构及重要催化活性中心区域为基本组合模块，得到24个基本单元（每一模块大约30-50碱基），其中2个模块分别为起始/终止序列。为成功构建多样性的文库，本课题探究了利用短引物延伸、重聚RCR和连接等多种方式进行模块间随机重组的方式，获得满意的多样性文库。所建立的文库可通过调整终止序列的比例来控制重组序列的长短。最后以设计的特异性引物对建立的文库进行PCR扩增，胶回收750-1000 bp长度的DNA条带，经双酶切后与构建的SV载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞内，进行卡那霉素抗性筛选和基因文库的功能性验证。.最终，通过对试验方案及条件的优化并对比分析测序结果，表明该技术构建了一个完全随机的多样化基因文库，充分说明基于蛋白质二级结构模块重组构建基因文库的方法的可行性。依据该方法可实现对小分子蛋白（100-200氨基酸）二级结构模块的有效重组，为后续小分子蛋白进行功能蛋白的筛选提供了有效的理论基础。在进行基因文库的功能性验证（抗性筛选）中，目前没有筛选出有功能的蛋白。因为形成的有功能蛋白需要正确的折叠方式，而引起形成正确折叠的原因比较复杂，目前正进行进一步研究。.核酸扩增是文库构建的基本环节，如何对所得到的有效突变体进行高质量扩增是研究的重要组成部分。因此，本课题在建立文库和文库筛选的工作之外，还对核酸等温扩增方法做了一系列研究工作，已在J. Am. Chem. Soc.，Anal. Chem.，Chem. Commun.等高水平学术期刊发表多篇学术论文，为构建多样性的基因文库和核酸快速检测提供了很好的扩增平台。